La extracción de fluidos controlados por densidad y temperatura en una biopelícula bacteriana se determina mediante poli

npj Biofilms and Microbiomes volumen 8, Número de artículo: 98 (2022) Citar este artículo

874 Accesos

3 Altmetric

Detalles de métricas

Un sello distintivo de las biopelículas microbianas es la autoproducción de una matriz molecular extracelular que encierra las células residentes. La matriz brinda protección contra el medio ambiente, mientras que la heterogeneidad espacial de la expresión génica influye en la morfología estructural y la dinámica de propagación de colonias. Bacillus subtilis es un sistema bacteriano modelo utilizado para descubrir las vías reguladoras y los componentes básicos necesarios para el crecimiento y desarrollo de biopelículas. En este trabajo, informamos sobre la aparición de una población de bacterias altamente activa durante las primeras etapas de la formación de biopelículas, facilitada por la extracción de líquido del sustrato de agar subyacente. El origen de esta extracción de fluidos se remonta a la producción de ácido poli-γ-glutámico (PGA). La actividad dependiente de flagelos se desarrolla detrás de un frente móvil de fluido que se propaga desde el límite de la biopelícula hacia el interior. La extensión de la proliferación de fluidos está controlada por la presencia de polisacáridos extracelulares (EPS). También encontramos que la producción de PGA se correlaciona positivamente con temperaturas más altas, lo que da como resultado morfologías de biopelículas maduras a alta temperatura que son distintas de la arquitectura de biopelículas de colonia rugosa típicamente asociada con B. subtilis. Aunque informes anteriores sugirieron que la producción de PGA no juega un papel importante en la morfología del biofilm en el aislado no domesticado NCIB 3610, nuestros resultados sugieren que esta cepa produce matrices de biofilm distintas en respuesta a las condiciones ambientales.

Una estrategia común empleada por las bacterias para mitigar el estrés impuesto por su entorno es coexistir en comunidades sésiles conocidas como biopelículas. La transición de la vida unicelular a la multicelular permite a los residentes coordinar las respuestas a los estímulos, compartir las cargas metabólicas1 y protegerse contra el ataque externo de depredadores2,3 o agentes antimicrobianos4,5. Este comportamiento es omnipresente en todo el mundo microbiano y una comprensión clara de la génesis, el desarrollo y la maduración del biofilm es importante tanto desde una perspectiva microbiológica fundamental, como también debido a su impacto en muchos sectores industriales, clínicos y biotecnológicos. Por ejemplo, los biofilms actúan como fuentes de muchas infecciones crónicas y sus características físicas las hacen difíciles de erradicar6,7. Esta intransigencia también puede afectar los procesos industriales, donde las biopelículas pueden provocar obstrucciones en las tuberías, inducir la corrosión o contaminar los productos8,9,10. Sin embargo, si bien la formación de biopelículas tiene muchas consecuencias negativas, las biopelículas microbianas desempeñan funciones vitales en el tratamiento de aguas residuales y otros procesos de biorremediación11,12,13,14 y es de fundamental interés comprender su formación y su alteración.

Bacillus subtilis es una bacteria Gram-positiva que se ha utilizado ampliamente como organismo modelo para investigar la regulación genética y los mecanismos moleculares de la formación de biopelículas15,16. Los principales componentes de la matriz producida por B. subtilis son la proteína fibrilar TasA17, el tensioactivo de proteína similar a la hidrofobina BslA18,19,20 y el polisacárido sintetizado por productos del operón epsA-O21. Una de las principales vías reguladoras que controla la expresión de estos componentes está modulada por el factor de transcripción Spo0A, con niveles moderados de Spo0A fosforilado activando la transcripción del operón sinI-sinR22,23. SinR es un factor de transcripción de unión al ADN que controla la producción de matriz al interactuar con los promotores epsA-O y tapA-sipW-tasA24. Cuando SinR se une a sus proteínas antagonistas (SinI y SlrR), se alivia la represión de estos operones y puede continuar la formación de biopelículas25,26.

En este trabajo, informamos sobre la observación de múltiples frentes fluidos que viajan que se desarrollan durante la etapa temprana de formación de biopelículas de colonias de B. subtilis. Después de la deposición inicial de las células fundadoras, emerge una población de bacterias altamente móvil que nada en el líquido extraído del sustrato de agar subyacente. Vinculamos genéticamente este frente móvil de fluido con la producción del polímero ácido poli-γ-glutámico (PGA). Encontramos que la entrada de líquido depende tanto de la densidad bacteriana como de la temperatura ambiental, y que la extensión de la infiltración de líquido a su vez está modulada por la producción de polisacárido extracelular (EPS). La producción de PGA a temperaturas más altas y la extracción concomitante de fluido afecta significativamente la morfología del biofilm maduro, que difiere de la estructura típica asociada con B. subtilis NCIB 3610. Nuestros resultados sugieren que B. subtilis tiene la capacidad de producir una alternativa matriz extracelular en respuesta a las condiciones ambientales.

Al comienzo de cada experimento, se depositó una suspensión de 3 μL de células de B. subtilis (OD600 = 1) en agar MSgg, un medio mínimo promotor de biopelículas27. Después de la inoculación, la gota se evapora, lo que da como resultado un patrón de deposición de "anillo de café": se forma un anillo de células bacterianas de alta densidad en el borde de la gota inicial, mientras que el interior está menos poblado (Fig. 1a). Esta distribución de las células fundadoras se debe a la tasa diferencial de evaporación a lo largo de la gota, lo que impulsa los flujos capilares que transportan las células desde el interior hasta el límite entre la gota y el agar sólido28. Nuestros experimentos iniciales se realizaron utilizando el aislado de tipo salvaje NCIB 3610 cultivado a 38 ∘C mientras se recopilaban imágenes con resolución temporal. Las imágenes se capturaron mediante imágenes a través del sustrato de agar, por lo que observamos la dinámica de crecimiento en la parte inferior de la biopelícula (Fig. 1a). Adquirimos imágenes para las ~ 6 h iniciales de crecimiento (Fig. 1b-d). La región del "anillo de café" de alta densidad es claramente identificable por la gran acumulación de células bacterianas cerca del límite exterior de la colonia (Fig. 1b). Esta región de alta densidad de bacterias parece tener varias capas con un ancho de 75 a 100 μm.

a Se deposita una gota de 3 μL de una suspensión bacteriana sobre la superficie del agar MSgg y se deja secar. Debido a las tasas diferenciales de evaporación en la superficie de la gota (flechas azules), se inducen flujos capilares en el interior de la gota. Esto permite el transporte de bacterias desde el interior de la gota hasta el borde donde se depositan. El efecto es una acumulación de una región de mayor densidad de bacterias en la línea de contacto entre la gota y el agar sólido. b Esta región de mayor densidad de bacterias se puede ver en el borde de la colonia (t = 60 min). c Después de tres horas de incubación y crecimiento, se desarrolla una región más oscura centrada en el borde de la biopelícula emergente. Encontramos que esta zona es fluida y comienza a moverse hacia adentro hacia el centro de la colonia (flechas azules; t = 220 min). En esta zona observamos células activas y móviles. d Después de otras dos horas, el frente deja de moverse hacia adentro, indicado por la línea discontinua blanca, y la motilidad se detiene (t = 330 min). Las barras de escala (b)–(d) son de 500 μm. e Análisis PIV que muestra el campo de magnitud de velocidad de una biopelícula de tipo salvaje en un intervalo de dos fotogramas (10 fps). La región azul es la biopelícula de la colonia; la región roja es el agar. Imagen capturada ~ 4,5 h después de la deposición. f Con el software de seguimiento de partículas, se ubican las perlas (rosa) y se realiza un seguimiento de su movimiento a lo largo del tiempo (líneas amarillas). La mayoría de las perlas se mueven linealmente a una velocidad constante hacia el interior de la colonia. Imagen capturada ~ 200 min después de la deposición. Barras de escala (e)–(f) 100 μm.

Después de que NCIB 3610 haya crecido durante ~3 h, observamos una zona que emerge de la región de alta densidad, que es visualmente diferente al interior de la colonia (ver el anillo oscuro en el borde en comparación con el interior más claro en la Fig. 1c) . Esta zona más oscura crece y se mueve hacia adentro como un frente viajero hacia el centro de la colonia (Película complementaria 1). Dentro de esta zona, observamos patrones coherentes de movimiento autoorganizado, como remolinos y vórtices, que recuerdan las estructuras observadas en los sistemas turbulentos activos (Película complementaria 2)29,30 que indican que las bacterias ahora se encuentran en un entorno fluido. Usamos Velocimetría de Imagen de Partículas (PIV) para evaluar más a fondo este movimiento. Encontramos regiones localizadas de alta vorticidad y velocidades que oscilan entre 1 y 10 μm/s con una media de 2,1 μm/s (Fig. 1e, Fig. 1 complementaria, Películas complementarias 3, 4). Para determinar si estos patrones emergentes se debían a la advección pasiva de las bacterias debido a los flujos de fluidos o si estaba involucrada la motilidad bacteriana, realizamos experimentos similares y PIV en una cepa no móvil que posee una deleción de motB, un elemento del estator flagelar requerido para rotación flagelar. Descubrimos que no observamos vórtices como lo hicimos con NCIB 3610 (Fig. 2 complementaria). Además, la velocidad promedio para la cepa motB es un orden de magnitud menor que NCIB 3610 (Figuras complementarias 2, 3). Estas observaciones apoyan la idea de que los flagelos activos o la motilidad son importantes para la formación de estas características dinámicas. Si estos patrones son un ejemplo de turbulencia activa debido a la motilidad bacteriana29, o debido a un acoplamiento entre el latido flagelar y el flujo de líquido hacia la colonia desde el agar que se encuentra debajo, está más allá del alcance de este trabajo. Independientemente, estos resultados muestran que las bacterias en esta fase de crecimiento de la colonia se encuentran en un entorno fluido. Este cese de la motilidad/actividad también ocurre como un frente de propagación (el "frente de detención de la motilidad"), sin embargo, viaja mucho más rápido que la propagación inicial del fluido y se mueve predominantemente desde el anillo interior del anillo hacia el anillo de café inicial exterior. (Para ver películas comentadas de esta dinámica, consulte Películas complementarias 5 y 6).

Para examinar más a fondo este frente fluido, agregamos perlas fluorescentes de 2 μm a la suspensión de bacterias que se depositaron al comienzo del experimento (Fig. 1e, Película complementaria 7). Con la entrada de fluido, las perlas se empujan a una velocidad constante de ≈2,5 μm min−1 (Fig. 1f). Por lo tanto, el movimiento de este frente tiene la capacidad de desplazar y empujar mecánicamente las perlas, y probablemente las células, hacia el centro de la colonia. En etapas posteriores, algunas perlas se vuelven erráticas en su movimiento, lo que probablemente indica que las perlas se ponen en movimiento por la acción de natación de las bacterias en un entorno fluido; una porción adicional de las perlas permanece incrustada dentro de la masa bacteriana.

Observamos consistentemente la formación de un anillo fluido que comienza en el borde exterior de la biopelícula, en lugar de inundar toda la colonia con fluido. Nuestra hipótesis es que la restricción del fluido a un anillo externo se debe a la producción de matriz extracelular dentro de la región central de la biopelícula, lo que evita una mayor incursión de fluido. Realizamos el mismo experimento descrito en la Fig. 1a utilizando una cepa en la que se elimina el represor clave de la formación de biopelículas (sinR). Sin sinR, las bacterias sobreproducen la matriz extracelular y las biopelículas de colonias altamente arrugadas ocupan una huella más pequeña (Fig. 4 complementaria)24. Como se predijo, la distancia máxima que el fluido invadió en el interior de la biopelícula en relación con el borde exterior de la colonia (Figuras complementarias 5, 6; Película complementaria 8) en la cepa sinR fue aproximadamente 3 veces menor que la cepa NCIB 3610 ( Figura 2).

Representada es la distancia promedio de recorrido del fluido medida desde el borde de la biopelícula. Tenga en cuenta que el eje y está en una escala logarítmica para mostrar las diferencias entre las cepas NCIB 3610, sinR, tasA y bslA y epsA-O. Cada punto de datos es la distancia media de viaje del fluido promediada en 10 puntos espaciales a través de una biopelícula individual (N = 3 para cada cepa). Las barras de error representan la desviación estándar. Cabe señalar que para la cepa epsA-O, la distancia recorrida por el fluido simplemente refleja el tamaño de la colonia, ya que el fluido que emana del límite no está confinado a un anillo sino que se encuentra en el centro. Aquí reportamos distancias para tres experimentos separados. Una prueba t no pareada entre NCIB 3610 y cada matriz mutante da valores p de ****p < 0,0001 (sinR), ****p < 0,0001 (tasA), **p = 0,0025 (bslA, *** *p < 0,0001 (epsA-O)). p < 0,05 se considera estadísticamente significativo.

A continuación, deseamos determinar si uno o más componentes individuales de la matriz son dominantes en el control de la extensión del flujo de fluido. Realizamos experimentos análogos en cepas con deleciones en los genes responsables de la producción de BslA (bslA), TasA (tasA) y EPS (epsA-O), midiendo nuevamente la distancia del recorrido del fluido. Descubrimos que el fluido viajó más en la cepa bslA en comparación con NCIB 3610, mientras que el flujo de fluido en la cepa tasA viajó menos (Fig. 2, Figs. complementarias 5, 7, 8; Películas complementarias 9, 10, 11). Si bien las diferencias entre NCIB 3610 y estos componentes de la matriz son estadísticamente significativas, el fluido todavía está contenido en una región anular dentro de la colonia. Sin embargo, para la cepa epsA-O, el fluido no se limitó a una región anular, sino que se propagó por todo el radio de la colonia (Fig. 2, Película complementaria 12) y con actividad celular observable en todas partes. La actividad fue muy dinámica y observamos la formación de vórtices característica de la turbulencia activa (Película complementaria 13). Nuevamente, realizamos un análisis PIV y encontramos regiones de alta vorticidad y una distribución de velocidad similar a la cepa de tipo salvaje (Figura complementaria 9, Películas complementarias 14, 15). El frente de detención de la motilidad es más evidente en el mutante epsA-O y, al igual que el frente de propagación de fluidos, viaja por toda la colonia (para ver películas editadas y comentadas de la dinámica del biofilm epsA-O, consulte las Películas complementarias 16 y 17). En conjunto, nuestros datos demuestran que el EPS es el principal componente de la matriz extracelular que controla la extensión de la invasión de fluidos en la biopelícula.

La cepa epsA-O nos permitió rastrear el flujo de líquido en toda la colonia de manera resuelta en el tiempo y aprender más sobre el proceso de extracción de líquido. Notamos que se desarrolla una inestabilidad similar a un dedo a medida que el fluido se propaga hacia adentro (Fig. 3a; Películas complementarias 8, 16–18). A medida que el fluido empuja hacia el centro de la colonia, el frente de fluido se vuelve inestable, formando dedos cada vez más grandes con el tiempo (Fig. 3a, b). Los patrones formados por estas inestabilidades recuerdan el patrón de arrugas observado en las biopelículas maduras.

a Un ejemplo de una imagen de microscopía de una biopelícula epsA-O completa (la barra de escala es de 500 μm). La región negra anular define el área donde observamos inestabilidades similares a dedos. Esta región anular se hace lineal para facilitar la visualización; se hace un corte en la línea roja y la región circular se 'desenrolla' para formar una región lineal. b Imágenes binarizadas de los dedos a lo largo del tiempo para la biopelícula en (a). c El desplazamiento normalizado en función del tiempo para el borde exterior de la colonia (círculos negros), el frente fluido (rombos verdes) y el frente de detención de la motilidad (cuadrados naranjas). Una meseta en la expansión del borde ocurre coincidentemente con el inicio de la propagación del fluido (que definimos como la 'meseta de fluidización'; cuadro rojo). El crecimiento se reinicia después de que se detiene la motilidad. La curva verde corresponde al momento en que observamos el desarrollo de los dedos en (a).

La obtención de imágenes del flujo de fluidos en biopelículas de colonias de esta manera nos permitió realizar un seguimiento completo de tres características clave de la dinámica: (1) la distancia recorrida por el borde exterior en expansión de la colonia en crecimiento; (2) la distancia recorrida por el flujo de fluido, como se indicó anteriormente; y (3) el frente de detención de la motilidad. Todas las medidas se tomaron en relación con la posición inicial (r0) de cada característica, y las distancias relativas se normalizaron por su valor máximo para permitir una comparación directa de su evolución dependiente del tiempo. En primer lugar, después de un lapso de tiempo, el borde exterior de la colonia comienza a expandirse a un ritmo constante, como se muestra en la Fig. 3c. Sin embargo, esta expansión hacia el exterior se ralentiza y luego se detiene precisamente en el momento en que vemos que el frente fluido comienza a propagarse desde el anillo de café hacia el interior de la colonia. Sugerimos que la entrada de líquido provoca una "fluidización" de la masa de biopelícula interior y la falta de robustez mecánica resultante impide la expansión hacia el exterior de la biopelícula. Solo con el inicio del frente de detención de la motilidad, y la resolidificación del interior, puede ocurrir una mayor expansión en el borde exterior de la biopelícula. Nos referimos a esta pausa en la expansión de la biopelícula debido a la entrada de líquido como la "meseta de fluidización" (recuadro rojo, Fig. 3c), y podemos usarla para investigar los cambios en las propiedades de la biopelícula.

Llama la atención que el frente fluido se mueva predominantemente radialmente desde el "anillo de café" hacia el centro de la colonia. Esto sugiere que la especie molecular responsable de la extracción de fluidos se produce de manera dependiente de la densidad celular. Para probar esta hipótesis, preparamos biopelículas de colonias con y sin una región inicial de alta densidad, revistiendo por rotación una suspensión de bacterias en el agar. Las muestras con una distribución heterogénea de células (como un anillo de café) siempre extraen fluido con una direccionalidad: el fluido siempre se propaga desde regiones de alta densidad a regiones de baja densidad (Películas complementarias 19, 20). Por el contrario, un depósito homogéneo de células eventualmente da como resultado un fluido que ingresa a la colonia en todas partes simultáneamente, sin dirección de propagación (Películas complementarias 21, 22). Estos hallazgos indican que existe cierta densidad celular crítica necesaria para inducir la extracción de fluidos.

Queríamos identificar las especies moleculares responsables de impulsar el flujo de fluidos y la posterior actividad y dinámica de crecimiento. La surfactina era un candidato obvio: es un lipopéptido producido por B. subtilis que es un poderoso biosurfactante31 y un potente agente antimicrobiano32. La producción de surfactina en las biopelículas de B. subtilis facilita la propagación de colonias33 y es importante en la extracción osmótica de líquido del sustrato de agar subyacente34. Para probar si la surfactina es el agente causante de la dinámica que observamos, eliminamos srfAA de las cepas de fondo de tipo salvaje y epsA-O. Como diagnóstico, medimos el desplazamiento relativo, r, del borde del biofilm en relación con la posición inicial del borde, r0 en función del tiempo (Fig. 4a). Si la surfactina es responsable del flujo de líquido hacia la biopelícula en crecimiento, la eliminación de srfAA debería dar como resultado una expansión de colonias sin obstáculos. Sin embargo, encontramos que las cepas srfAA y srfAA epsA-O exhibieron la "meseta de fluidización" característica mostrada por la cepa parental (Fig. 4a); por lo tanto, la surfactina no es el agente causante de la extracción de líquido observada.

a Las mediciones del desplazamiento del borde exterior a 38 ∘C muestran que las cepas NCIB 3610 (círculos negros), epsA-O (diamantes verdes), srfAA (más púrpura) y srfAA epsA-O (estrella gris) poseen la característica `fluidización meseta'. La tensión pgsB menos (cuadrado naranja) y pgsB epsA-O menos (cruz cian) que no pueden producir PGA no mostraron este comportamiento. Morfología de la colonia después de 48 horas de incubación a 38 ∘C de b NCIB 3610, c pgsB, d srfAA, e epsA-O, f pgsB epsA-O y g srfAA epsA-O. La barra de escala es de 5 mm.

El ácido poli-γ-glutámico es un biopolímero natural que consta de unidades repetitivas de ácido L-glutámico, ácido D-glutámico o ambos, producido por especies de Bacillus35,36. La producción de PGA depende de la densidad37, de acuerdo con nuestras observaciones, y tiene propiedades humectantes38,39. Para probar si PGA es responsable de la extracción de fluidos, eliminamos pgsB de las cepas de fondo de tipo salvaje y epsA-O. PgsB es la sintetasa esencial necesaria para la producción de PGA40. Observamos una meseta de fluidización en la expansión de colonias para las cepas de tipo salvaje y epsA-O, pero no para los dos mutantes pgsB (Fig. 4a). Cuando no hay PGA, la biopelícula no se 'fluidifica' y la expansión de la biopelícula continúa sin interrupciones. Por lo tanto, concluimos que el PGA es el agente molecular que extrae el fluido del sustrato, impulsando el inicio de la motilidad y la fluidización del biofilm.

También tomamos imágenes de la morfología del biofilm después de 48 horas de incubación y descubrimos que el mutante pgsB y de tipo salvaje son morfológicamente similares (Fig. 4b, c). Las dos cepas epsA-O son igualmente comparables, pero diferentes a la morfología de tipo salvaje (Fig. 4e, f). Para completar, también tomamos imágenes de las biopelículas mutantes de surfactina y descubrimos que la cepa srfA está estructurada pero ocupa una huella pequeña, mientras que el doble mutante srfA pgsB está menos estructurado, similar a las otras cepas que no producen EPS (Fig. 4d, g) . Por lo tanto, como se discutió anteriormente, el flujo de fluido hacia el biofilm de la colonia en tiempos tempranos no altera apreciablemente la morfología, y la producción de matriz todavía gobierna los fenotipos estructurales de los biofilms maduros.

Nuestro análisis inicial se realizó a 38 ∘C, mientras que la mayoría de los otros estudios que investigan la formación de biopelículas de B. subtilis generalmente se realizan entre temperatura ambiente y 30 ∘C. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que la producción de PGA no solo depende de la densidad celular, sino también de la temperatura. Para probar esta hipótesis, repetimos los experimentos que examinan el flujo de fluidos y la morfología del biofilm de colonias con cepas de tipo salvaje, epsA-O, pgsB y pgsB epsA-O a temperaturas adicionales de 30 ∘C y 42 ∘C (la temperatura más alta alcanzable en nuestra incubadora de microscopía). A 30 ∘C, no observamos ningún flujo de fluido en la biopelícula de la colonia ni una meseta de fluidización en la expansión del borde para ninguna de las cepas, incluso las cepas de tipo salvaje y epsA-O (Fig. 5a). Este resultado sugiere que no se produce PGA a 30 ∘C. A las temperaturas más altas de 38 ∘C y 42 ∘C, encontramos una meseta en las curvas de expansión de borde para las cepas capaces de producir PGA, aunque la meseta a la temperatura más alta es menos pronunciada. No se observa meseta para los mutantes deficientes en PGA (Figs. 4a y 5b).

a Mediciones de la expansión del borde a 30 ∘C y b 42 ∘C para NCIB 3610 (círculo negro), epsA-O (rombo verde), pgsB (cuadrado naranja), pgsB epsA-O (cruz cian). Morfología de la colonia después de 48 h de incubación a c–f 30 ∘C y g–j 50 ∘C. La barra de escala es de 5 mm. k Análisis de la abundancia de PGA por electroforesis en gel de poliacrilamida de muestras extraídas de NCIB 3610 y pgsB después del crecimiento a 38 ∘C y 50 ∘C.

Además, encontramos que NCIB 3610 forma colonias extremadamente mucoides en placas de agar MSgg a 50 ∘C (Fig. 5g). La mucosidad era tal que cuando se invertía la placa petri, la biomasa caía sobre la tapa. Observamos fenotipos similares para colonias incapaces de producir EPS y surfactina (Fig. 5h, Fig. 10 complementaria). Descubrimos que el fenotipo mucoide estaba directamente relacionado con la producción de PGA ya que las cepas de deleción de pgsB eran completamente no mucoides (Fig. 5i, j). Para completar, se examinaron las mismas cepas a 30 ∘C, y no se observaron diferencias en la estructura de la arquitectura del biofilm de colonias NCIB 3610 y pgsB (Fig. 5c, e); asimismo, los mutantes epsA-O y pgsB epsA-O son morfológicamente comparables (Fig. 5d, f). Para respaldar los datos fenotípicos, recolectamos la biomasa de las cepas NCIB 3610 y pgsB cultivadas a 38 ∘C y 50 ∘C y evaluamos bioquímicamente la producción de PGA. Concluimos que 3610 produce grandes cantidades de PGA a 50 ∘C pero no a 38 ∘C (Fig. 5K). Los mutantes de matriz de NCIB 3610 que contienen deleciones en bslA, tasA y epsA-O forman biopelículas mucoides similares a 50 ∘C (Fig. 10 complementaria). Solo el mutante que posee una deleción en sinR, mientras aún es mucoide, produce una biopelícula con características estructurales rugosas (Fig. 10 complementaria). En conjunto, nuestros datos respaldan la conclusión de que el PGA se produce en NCIB 3610 de manera dependiente de la densidad celular y la temperatura, y muestra que la arquitectura y la estructura del biofilm pueden, bajo ciertas condiciones, verse dramáticamente influenciadas por la producción de PGA.

Hemos demostrado que B. subtilis produce PGA que induce un flujo de líquido en una colonia de biopelícula en crecimiento. Este flujo ascendente de líquido conduce a una actividad celular dependiente de flagelos que, en estas condiciones de alta densidad y confinamiento, da como resultado una dinámica turbulenta. Ha sido bien establecido que los estados de células móviles y productoras de matriz de biopelícula son mutuamente excluyentes41,42; las células individuales pueden estar en sólo uno de los dos estados. También se ha demostrado, tanto para las especies grampositivas como para las gramnegativas, que a menudo se requiere motilidad flagelada activa para el desarrollo de biopelículas y el papel que desempeña es múltiple43,44,45,46,47,48.

Todavía no está claro qué función puede desempeñar la motilidad inducida por PGA en el desarrollo de biopelículas de B. subtilis. Es intrigante que los mismos reguladores transcripcionales requeridos para la motilidad49 también sean necesarios para la síntesis de PGA37,50,51. Sin embargo, trabajos anteriores también han demostrado que existe una relación inversa entre la síntesis de PGA y la función flagelar52,53, lo que sugiere que la motilidad que observamos puede ser simplemente un subproducto de las células que se encuentran en un entorno fluido. Los mecanismos reguladores precisos que controlan la síntesis y la motilidad de PGA son complejos y se requiere más trabajo para comprender mejor los vínculos entre los dos.

De nuestros experimentos está claro que las altas temperaturas inducen a la colonia a retirar un volumen considerable de líquido del sustrato de agar. Trabajos previos han demostrado que la PGA puede conferir protección a las bacterias y aumentar la supervivencia bajo muchos estreses ambientales diferentes54,55,56,57. Es plausible que cuando una biopelícula está sujeta a temperaturas elevadas, la producción de PGA eliminaría y retendría la humedad que, de lo contrario, podría perderse por evaporación, evitando así la desecación de la colonia. Nuestra observación del inicio de la motilidad destaca otra ventaja potencial de la producción de PGA en un entorno cambiante: la propagación activa (o incluso pasiva) puede facilitar el escape y la búsqueda de entornos más adecuados para colonizar.

La matriz de biopelícula de B. subtilis y V. cholerae se ha modelado como una red de hidrogel viscoso que facilita la expansión de la biopelícula a través de la entrada de fluido osmótico58,59,60,61. Se cree que la localización de la producción de EPS en el límite de propagación de una colonia en crecimiento impulsa la expansión hacia el exterior de la biopelícula. La producción concomitante de osmolitos estimula la extracción de fluidos que hincha la matriz en el límite de crecimiento, impulsando el movimiento hacia adelante. En nuestros experimentos, PGA parece tener el efecto contrario: la expansión de la colonia se detiene debido a que la colonia entra en un estado 'líquido' cuando se extrae el fluido del sustrato. Trabajos previos han demostrado que la expansión de la biopelícula de colonias se rige en gran medida por las fuerzas de contacto mecánico entre las células vecinas y la fricción con el sustrato subyacente62,63,64. En nuestros experimentos, la expansión solo se reinicia cuando el entorno fluido se disipa, se restauran los contactos físicos y comienza la producción de matriz no PGA. Esto plantea otra pregunta: ¿cómo se produce la expansión de colonias cuando PGA es el componente principal de la matriz? Nuestros experimentos a altas temperaturas muestran que la cepa 3610 de tipo salvaje se expande significativamente más allá de la huella de deposición inicial. Las cepas que no producen EPS o surfactina no se expanden tanto como el tipo salvaje, lo que sugiere que estos componentes tienen un papel que desempeñar para facilitar la expansión de la colonia (Figura 10 complementaria).

Las ondas viajeras de fluido en la tensión deficiente en epsA-O dan como resultado la aparición de estructuras en forma de dedos a medida que la onda se propaga hacia adentro. Tales inestabilidades de digitación pueden ocurrir cuando un fluido de baja viscosidad desplaza a uno de mayor viscosidad; la situación inversa normalmente dará como resultado una interfaz estable. Curiosamente, en nuestros experimentos los dedos aparecen en la configuración inversa. Tales inestabilidades inversas de Saffman-Taylor pueden ocurrir mediante la adición de partículas humectables que pueden adsorberse en la interfaz aire/líquido e inducir inestabilidades interfaciales65. Se sabe que las bacterias pueden acumularse en las interfases66, y B. subtilis lo demuestra al formar biopelículas flotantes (películas). Especulamos que en nuestro sistema experimental, las células de B. subtilis se acumulan al frente de la onda de fluido entrante, modificando la energía interfacial y desestabilizando la interfaz entre el fluido y el aire, y dando lugar a la inestabilidad de digitación observada. La localización de las células en estas interfaces también puede dar lugar a gradientes de densidad celular, que a su vez pueden evolucionar como patrones en la biopelícula madura. Será necesario trabajar más para descubrir los mecanismos biológicos y físicos que causan este fenómeno inusual y cualquier posible beneficio o función en entornos ecológicos.

Nuestros experimentos a temperaturas intermedias (38 ∘C) sugieren una separación espacial entre las células productoras de PGA en el borde de la biopelícula de la colonia y las células productoras de matriz en el medio (como se informó anteriormente67), lo que resulta en el confinamiento anular de líquido. Tal heterogeneidad espacial y temporal es una característica común en las biopelículas donde el microambiente local puede influir fuertemente en el estado fenotípico de las células. La heterogeneidad fenotípica dentro de una biopelícula puede generarse a partir de variaciones en el entorno físico o químico68,69, variaciones genotípicas y expresión génica estocástica68.

La heterogeneidad en la densidad celular impuesta por las condiciones de depósito iniciales y la formación del "anillo de café" conduce al patrón espacial de extracción de fluidos que observamos. Sin embargo, este no es el único medio de generar diferencias de densidad dentro de una biopelícula. Los agregados formados durante el crecimiento en cultivo líquido pueden sembrar parches de mayor densidad celular a lo largo de la huella de deposición. De hecho, observamos que la invasión de fluidos y, por inferencia, la producción de PGA pueden ocurrir en pequeñas regiones localizadas lejos del "anillo de café" (Película complementaria 23). Esto sugiere que existe una densidad celular crítica que determina si una célula individual adopta un estado productor de PGA sobre uno productor de matriz.

La heterogeneidad espacial es transitoria a 38 ∘C, y el EPS se convierte en el componente dominante de la matriz que determina la morfología del biofilm a gran escala. El flujo de fluido finalmente se detiene por la producción del elemento EPS de la matriz en la región media de la biopelícula (Fig. 6b). Las células móviles que están cerca de las células productoras de EPS parecen dejar de moverse abruptamente y un frente sólido avanza rápidamente desde el centro de la colonia hacia el exterior. Un mecanismo que podría explicar esta transición implica la participación de un "embrague molecular" como EpsE, que se une a FliG y desencadena la detención de la motilidad70. Sin embargo, podemos descartar EpsE como candidato ya que observamos la propagación del frente de detención de la motilidad en la cepa epsA-O. Sigue siendo una pregunta abierta qué mecanismo(s) físico(s) o biológico(s) gobiernan este fenómeno similar a un interruptor.

El "anillo de café" es la región inicial de mayor densidad que se forma después de la deposición sobre la superficie del agar. a Las bajas temperaturas producen una matriz de biopelícula rica en EPS y TasA (amarillo). b Las temperaturas intermedias inducen la producción de PGA (azul) y (i) la extracción de fluido concomitante del agar que se origina en la región de alta densidad. (ii) El fluido se propaga hacia el centro donde (iii) la producción de matrices EPS y TasA detiene su avance. c Las altas temperaturas dan como resultado una matriz rica en PGA que induce (i) la extracción de fluidos que (ii) cubre toda la biopelícula y da como resultado un fenotipo mucoide.

A bajas temperaturas no observamos la heterogeneidad fenotípica que observamos a temperaturas intermedias, presumiblemente debido a la falta de producción de PGA (Fig. 6a) a pesar de la alta densidad celular en el anillo de café. Por el contrario, a altas temperaturas, las biopelículas son extraordinariamente mucoides y carecen de cualquier estructura perceptible típica de una biopelícula de B. subtilis (Fig. 6c). En cualquiera de los extremos, cualquier producción de PGA dependiente de la densidad celular es reemplazada por una vía dependiente de la temperatura que afecta a toda la biopelícula.

Cuando se diseñaron para producir en exceso las fibras TasA y el exopolisacárido mediante la introducción de una mutación en sinR, las biopelículas formadas a alta temperatura (Fig. 10 complementaria) eran muy mucoides pero también poseían una morfología más típica de una biopelícula de B. subtilis de tipo salvaje. . Esto implica que la producción de PGA puede ocurrir simultáneamente con EPS/TasA, incluso si las células individuales de la población se comprometen a producir uno u otro producto. Esta bifurcación en dos poblaciones es sugerida por nuestros hallazgos a temperaturas intermedias, donde los dos tipos de células parecen estar presentes al mismo tiempo, pero en diferentes regiones de la biopelícula.

Trabajos previos han demostrado que las cepas que poseen una deleción de spo0A dan como resultado biopelículas mucoides y desestructuradas a bajas temperaturas (30 ∘C) y que esto se debe a la producción de PGA27,71. Por lo tanto, un mutante spo0A imita ampliamente el fenotipo de biopelícula de tipo salvaje que observamos a altas temperaturas. Esto implica que Spo0A puede ser el componente regulador que controla la producción dependiente de la temperatura de una matriz de biopelícula rica en PGA o EPS/TasA.

En conjunto, estos resultados implican que B. subtilis tiene la capacidad de producir diferentes matrices de biopelículas con distintas propiedades para adaptarse a condiciones ambientales dispares. Tal estrategia puede emplearse en ambientes naturales dado que B. subtilis puede crecer en un amplio rango de temperaturas: se encuentra en suelos desérticos y dentro de compost que pueden alcanzar fácilmente temperaturas de 50 ∘C. Hasta ahora, no se pensaba que el PGA fuera un factor importante como componente de la matriz en las biopelículas NCIB 3610 de B. subtilis37. Sin embargo, parece que, en las condiciones adecuadas, el PGA puede convertirse en un componente de matriz alternativo con distintas características estructurales y físicas que pueden ayudar a la biopelícula a sobrevivir en condiciones de alta temperatura.

Las cepas de B. subtilis se cultivaron inicialmente en medio LB (10 g de NaCl, 5 g de extracto de levadura y 10 g de triptona por litro). Las biopelículas se cultivaron en agar MSgg (fosfato de potasio 5 mM y MOP 100 mM a pH 7,0 suplementado con MgCl2 2 mM, CaCl2 700 μM, MnCl2 50 μM, FeCl3 50 μM, ZnCl2 1 μM, tiamina 2 μM, glicerol al 0,5 % v/v) , glutamato al 0,5 % p/v, agar selecto al 1,5 % p/v (Invitrogen) Cuando fue apropiado, se usaron los antibióticos necesarios en las siguientes concentraciones: cloranfenicol a 5 μg ml−1, kanamicina a 25 μg ml−1, espectinomicina a 100 μg ml−1 y tetraciclina a 10 μg ml−1.

Todas las cepas utilizadas en este estudio se proporcionan en la Tabla complementaria 1. Todas las cepas de B. subtilis utilizadas en este trabajo se derivan del aislado de laboratorio de tipo salvaje NCIB 3610 y se construyen utilizando protocolos estándar. Se usó la transducción del fago SPP1 para la transferencia de ADN genómico de la cepa donante al receptor NCIB 3610.

Las biopelículas de colonias se cultivaron durante 24 h, momento en el cual se recolectó la biomasa de la superficie del agar y se colocó en una alícuota de 500 μl de BugBusterⓇ Mastermix (Merck). El material se disgregó mediante el paso repetido a través de una aguja de calibre 23 y luego mediante sonicación (30 % de amplitud, 10 s). Las muestras se incubaron a 21 ∘C (con agitación) durante 20 min y se centrifugaron a 4 ∘C (17 000 × g) durante 10 min. El sobrenadante se retuvo y contenía PGA y proteínas extraídas. Las muestras se cuantificaron utilizando un kit de ensayo de proteínas Pierce BCA (Thermo Scientific) y se almacenaron a -20 ∘C antes de su posterior análisis.

Las muestras que contenían 10 μg de proteína total (normalizadas a 25 μl en tampón de muestra 1x laemelli) se analizaron mediante SDS-PAGE (gel de resolución al 12 % p/v y gel de apilamiento al 7 % p/v) junto con una escalera de peso molecular (Precision Plus Protein Estándares de doble color (Biorad)). Todos los geles se procesaron en paralelo y se corrieron a 180 V hasta que el frente de colorante azul en el colorante de carga de la muestra llegó al fondo del gel. Los geles de acrilamida se enjuagaron minuciosamente en agua y se empaparon en tinción de proteína Instant Blue Coomassie (Abcam) durante 1 h con balanceo suave. Después de la incubación en la mancha, los geles se enjuagaron con agua desionizada y se tomaron imágenes utilizando un sistema Molecular Imager Gel Doc XR (Biorad). Los geles se empaparon adicionalmente en azul de metileno al 0,5 % (p/v) en ácido acético al 3 % (v/v) durante 10 min y luego se lavaron repetidamente en agua desionizada hasta que se eliminó el colorante de fondo no unido.

Se inocularon cepas de B. subtilis en 3 ml de LB de una única colonia cultivada en agar LB al 1,5 % p/v. Se permitió que las bacterias crecieran a 30 ∘C con agitación orbital de 200 rpm hasta alcanzar una DO entre 1,5 y 2. El cultivo celular se diluyó a DO600 1,0 en solución salina tamponada con fosfato. Se depositó una gota de bacterias de 3 μL en una placa de Petri de 35 mm (Corning) que contenía agar MSgg. Las gotitas de bacterias se dejaron secar durante 10 min. Para las muestras preparadas mediante revestimiento por rotación, se colocó una placa de Petri que contenía agar MSgg en un revestimiento por rotación al vacío (Cammax Precima) que giraba a 2000 rpm. Se colocó una gota de bacterias de 10 μL en el agar rotatorio. Para todos los experimentos, la placa de Petri se colocó en un microscopio invertido Nikon Ti con control de temperatura. Todas las imágenes y películas de microscopía se capturaron con una cámara CCD CoolSNAP HQ2 controlada por el software μManager. Se capturaron películas de campo claro e imágenes de las biopelículas desde la parte inferior de la placa de Petri y se tomaron imágenes a través del agar (grosor ~ 4 mm). En la adquisición de imágenes se utilizaron objetivos Nikon Plan 2x UW y 10X Plan Fluor. Se realizaron imágenes de biopelículas adicionales utilizando un estereoscopio Leica MZ16. Para los experimentos de seguimiento de perlas, se diluyeron perlas fluorescentes amarillas de poliestireno modificadas con carboxilato de látex de 1 μm de diámetro (Sigma-Aldrich) en PBS de la solución madre en una proporción de 1:1000. Se añadió 1 μL de la solución de trabajo al 1 mL del cultivo celular diluido justo antes de la deposición. Las películas se adquirieron en canales brillantes y epifluorescentes (cubo de filtro fluorescente Nikon GFP) y las perlas se rastrearon utilizando el complemento ImageJ TrackMate (v3.8.0)72. El análisis de imágenes se realizó utilizando la distribución de Fiji de ImageJ. Las imágenes de microscopía de biopelículas completas se capturaron como se indicó anteriormente, pero en múltiples mosaicos que se unieron mediante el complemento 'Costura por pares'. Las imágenes de las inestabilidades de digitación se generaron utilizando primero la herramienta 'enderezar' para transformar una región circular en una lineal. Se aplicó el método de umbral ImageJ predeterminado para binarizar las imágenes. En los casos en que la intensidad variaba a lo largo de la imagen, la imagen se dividía en regiones de intensidad similar y luego se realizaba un umbral. La herramienta de "búsqueda de bordes" se utilizó para localizar los bordes de las imágenes con umbral. Después de identificar los bordes, se rellenó el interior para formar una representación de los dedos. Si la imagen se dividió, la imagen se unió usando la herramienta de unión en ImageJ. La medición de la distancia de recorrido del fluido se rastreó manualmente en ImageJ y el desplazamiento medio se promedió en 10 mediciones separadas para cada experimento. Para cada cepa estudiada, se realizaron tres experimentos separados. Las mediciones de desplazamiento de borde y frente se realizaron de manera similar en ImageJ mediante el seguimiento manual del movimiento del frente en fotogramas sucesivos. Los desplazamientos siempre se midieron en relación con la posición inicial de cada característica. El análisis PIV se realizó con PIVlab (v2.39)73,74. Las imágenes se procesaron primero utilizando un filtro CLAHE con un tamaño de ventana de 20 píxeles. Se utilizaron tres pases de interrogación con tamaños de ventana de 64/32 píxeles, 32/16 píxeles y 16/8 píxeles. El estimador de subpíxeles utilizado fue el Gauss de 2x3 puntos. Se aplicaron máscaras de imagen para limitar la estimación de vectores espurios y los vectores se rechazaron si superaban las 5 desviaciones estándar de la media.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Todos los datos utilizados en este estudio se depositarán en Edinburgh DataShare (https://doi.org/10.7488/ds/3473). Cualquier dato también está disponible previa solicitud a los autores correspondientes.

Kearns, DB División del trabajo durante la formación de biopelículas de Bacillus subtilis. mol. Microbiol. 67, 229–231 (2008).

Artículo CAS Google Académico

Kadouri, D. & O'Toole, GA Susceptibilidad de las biopelículas al ataque del bacteriovirus Bdellovibrio. aplicación Reinar. Microbiol. 71, 4044–4051 (2005).

Artículo CAS Google Académico

Vidakovic, L., Singh, PK, Hartmann, R., Nadell, CD y Drescher, K. La arquitectura dinámica de biopelículas confiere mecanismos individuales y colectivos de protección viral. Nat. Microbiol. 3, 26–31 (2018).

Artículo CAS Google Académico

Stewart, PS & Costerton, JW Resistencia a antibióticos de bacterias en biopelículas. Lancet 358, 135–138 (2001).

Artículo CAS Google Académico

Fux, CA, Costerton, JW, Stewart, PS y Stoodley, P. Estrategias de supervivencia de biopelículas infecciosas. Tendencias Microbiol. 13, 34–40 (2005).

Artículo CAS Google Académico

Costerton, JW, Stewart, PS & Greenberg, EP Biopelículas bacterianas: una causa común de infecciones persistentes. Ciencia 284, 1318–1322 (1999).

Artículo CAS Google Académico

Trautner, BW & Darouiche, RO Papel de la biopelícula en la infección del tracto urinario asociada al catéter. Soy. J. Control de infecciones 32, 177–183 (2004).

Artículo Google Académico

Stoodley, P., DeBeer, D. y Lewandowski, Z. Flujo de líquido en sistemas de biopelícula. aplicación Reinar. Microbiol. 60, 2711-2716 (1994).

Artículo CAS Google Académico

Garrett, TR, Bhakoo, M. & Zhang, Z. Adhesión bacteriana y biopelículas en superficies. prog. Nat. Ciencia 18, 1049–1056 (2008).

Artículo CAS Google Académico

Beech, IB & Sunner, J. Biocorrosión: hacia la comprensión de las interacciones entre biopelículas y metales. Opinión actual. Biotecnología. 15, 181–186 (2004).

Artículo CAS Google Académico

Singh, R., Paul, D. & Jain, RK Biopelículas: implicaciones en la biorremediación. Tendencias Microbiol. 14, 389–397 (2006).

Artículo CAS Google Académico

Malik, A. Biorremediación de metales a través de células en crecimiento. Reinar. En t. 30, 261–278 (2004).

Artículo CAS Google Académico

Lazarova, V. & Manem, J. Caracterización de biopelículas y análisis de actividad en el tratamiento de aguas y aguas residuales. Agua Res. 29, 2227–2245 (1995).

Artículo CAS Google Académico

Ivnitsky, H. et al. Composición de la comunidad bacteriana y estructura de biopelículas en desarrollo sobre membranas de nanofiltración aplicadas al tratamiento de aguas residuales. Agua Res. 41, 3924–3935 (2007).

Artículo CAS Google Académico

Vlamakis, H., Chai, Y., Beauregard, P., Losick, R. & Kolter, R. Unidos: construyendo una biopelícula a la manera de Bacillus subtilis. Nat. Comentarios Microbiol. 11, 157 (2013).

Artículo CAS Google Académico

Arnaouteli, S., Bamford, NC, Stanley-Wall, NR y Kovács, Á. T. Bacillus subtilis formación de biopelículas e interacciones sociales. Nat. Rev. Microbiol. 19, 600–614 (2021).

Artículo CAS Google Académico

Romero, D., Aguilar, C., Losick, R. & Kolter, R. Las fibras amiloides proporcionan integridad estructural a las biopelículas de Bacillus subtilis. proc. Academia Nacional. ciencia EE. UU. 107, 2230–2234 (2010).

Artículo CAS Google Académico

Hobley, L. et al. BslA es una hidrofobina bacteriana autoensamblada que recubre la biopelícula de Bacillus subtilis. proc. Academia Nacional. ciencia EE. UU. 110, 13600–13605 (2013).

Artículo CAS Google Académico

Bromley, KM et al. Autoensamblaje interfacial de una hidrofobina bacteriana. proc. Academia Nacional. ciencia EE. UU. 112, 5419–5424 (2015).

Artículo CAS Google Académico

Kobayashi, K. & Iwano, M. Bsla (YuaB) forma una capa hidrofóbica en la superficie de las biopelículas de Bacillus subtilis. mol. Microbiol. 85, 51–66 (2012).

Artículo CAS Google Académico

Marvasi, M., Visscher, PT & Casillas Martinez, L. Sustancias exopoliméricas (EPS) de Bacillus subtilis: polímeros y genes que codifican su síntesis. FEMS Microbiol. Letón. 313, 1–9 (2010).

Artículo CAS Google Académico

Verhamme, DT, Murray, EJ & Stanley-Wall, NR DegU y Spo0A controlan conjuntamente la transcripción de dos loci necesarios para el desarrollo de colonias complejas por Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 191, 100–108 (2009).

Artículo CAS Google Académico

Shafikhani, SH, Mandic-Mulec, I., Strauch, MA, Smith, I. y Leighton, T. Regulación postexponencial de la expresión del operón sin en Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 184, 564–571 (2002).

Artículo CAS Google Académico

Kearns, DB, Chu, F., Branda, SS, Kolter, R. y Losick, R. Un regulador maestro para la formación de biopelículas por Bacillus subtilis. mol. Microbiol. 55, 739–749 (2005).

Artículo CAS Google Académico

Bai, U., Mandic-Mulec, I. & Smith, I. SinI modula la actividad de SinR, una proteína de cambio de desarrollo de Bacillus subtilis, mediante la interacción proteína-proteína. Genes Dev. 7, 139–148 (1993).

Artículo CAS Google Académico

Kobayashi, K. SlrR/SlrA controla el inicio de la formación de biopelículas en Bacillus subtilis. mol. Microbiol. 69, 1399–1410 (2008).

Artículo CAS Google Académico

Branda, SS, González-Pastor, JE, Ben-Yehuda, S., Losick, R. & Kolter, R. Formación de cuerpos fructíferos por Bacillus subtilis. proc. Academia Nacional. ciencia EE. UU. 98, 11621–11626 (2001).

Artículo CAS Google Académico

Deegan, RD et al. El flujo capilar como causa de las manchas anulares de gotas líquidas secas. Naturaleza 389, 827–829 (1997).

Artículo CAS Google Académico

Dunkel, J. et al. Dinámica de fluidos de la turbulencia bacteriana. física Rev. Lett. 110, 228102 (2013).

Artículo Google Académico

Sanchez, T., Chen, DTN, DeCamp, SJ, Heymann, M. & Dogic, Z. Movimiento espontáneo en materia activa ensamblada jerárquicamente. Naturaleza 491, 431–434 (2012).

Artículo CAS Google Académico

Deleu, M. et al. Propiedades interfaciales y emulsionantes de lipopéptidos de Bacillus subtilis. Coloides Superficies A: Physicochem. Ing. Aspectos 152, 3–10 (1999).

Artículo CAS Google Académico

Nakano, MM, Marahiel, MA & Zuber, P. Identificación de un locus genético requerido para la biosíntesis del antibiótico lipopéptido surfactina en Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 170, 5662–5668 (1988).

Artículo CAS Google Académico

Angelini, TE, Roper, M., Kolter, R., Weitz, DA y Brenner, MP Bacillus subtilis se propaga al navegar sobre olas de surfactante. proc. Academia Nacional. ciencia EE. UU. 106, 18109–18113 (2009).

Artículo CAS Google Académico

Hennes, M., Tailleur, J., Charron, G. & Daerr, A. Active depinning de gotitas bacterianas: el surf colectivo de Bacillus subtilis. proc. Academia Nacional. ciencia EE. UU. 114, 5958–5963 (2017).

Artículo CAS Google Académico

Moradali, MF & Rehm, BHA Biopolímeros bacterianos: desde la patogénesis hasta los materiales avanzados. Nat. Rev. Microbiol. 18, 1–16 (2020).

Candela, T. & Fouet, A. Poli-gamma-glutamato en bacterias. mol. Microbiol. 60, 1091–1098 (2006).

Artículo CAS Google Académico

Stanley, NR & Lazazzera, BA Definición de las diferencias genéticas entre las cepas silvestres y domésticas de Bacillus subtilis que afectan la producción de ácido poli-γ-dl-glutámico y la formación de biopelículas. mol. Microbiol. 57, 1143–1158 (2005).

Artículo CAS Google Académico

Shih, L. y Van, Y.-T. La producción de poli-(ácido γ-glutámico) a partir de microorganismos y sus diversas aplicaciones. Tecnología de biorecursos. 79, 207–225 (2001).

Artículo CAS Google Académico

Luo, Z. et al. Síntesis microbiana de ácido poli-γ-glutámico: progreso actual, desafíos y perspectivas futuras. Biotecnología. Biocombustibles 9, 134 (2016).

Artículo Google Académico

Hsueh , Y.-H. , Huang , K.-Y. , Good , SC & Lee , T.-Y. Síntesis de ácido poli-γ-glutámico, regulación génica, relaciones filogenéticas y papel en la fermentación. En t. J. Mol. ciencia Rev. 18, 2644 (2017).

Artículo Google Académico

Chai, Y., Chu, F., Kolter, R. & Losick, R. Biestabilidad y formación de biopelículas en Bacillus subtilis. mol. Microbiol. 67, 254–263 (2008).

Artículo CAS Google Académico

López, D. & Kolter, R. Señales extracelulares que definen destinos celulares distintos y coexistentes en Bacillus subtilis. FEMS Microbiol. Rev. 34, 134–149 (2010).

Artículo Google Académico

O'Toole, GA & Kolter, R. Flagellar y la motilidad de espasmos son necesarios para el desarrollo de biopelículas de Pseudomonas aeruginosa. mol. Microbiol. 30, 295–304 (1998).

Artículo Google Académico

Watnick, PI, Lauriano, CM, Klose, KE, Croal, L. & Kolter, R. La ausencia de un flagelo conduce a una alteración de la morfología de las colonias, el desarrollo de biopelículas y la virulencia en Vibrio cholerae O139. mol. Microbiol. 39, 223–235 (2001).

Artículo CAS Google Académico

Lemon, KP, Higgins, DE & Kolter, R. La motilidad flagelar es fundamental para la formación de biopelículas de Listeria monocytogenes. J. Bacteriol. 189, 4418–4424 (2007).

Artículo CAS Google Académico

Houry, A., Briandet, R., Aymerich, S. & Gohar, M. Participación de la motilidad y los flagelos en la formación de biopelículas de Bacillus cereus. Microbiología 156, 1009–1018 (2010).

Artículo CAS Google Académico

Serra, DO, Richter, AM, Klauck, G., Mika, F. y Hengge, R. Microanatomía en resolución celular y orden espacial de diferenciación fisiológica en una biopelícula bacteriana. mBio 4, e01464–18 (2013).

Artículo Google Académico

Haiko, J. & Westerlund-Wikström, B. El papel del flagelo bacteriano en la adhesión y la virulencia. Biología 2, 1242–1267 (2013).

Artículo Google Académico

Calvio, C., Osera, C., Amati, G. & Galizzi, A. Autorregulación de swrAA y motilidad en Bacillus subtilis. J. Bacteriol. Rev. 190, 5720–5728 (2008).

Artículo CAS Google Académico

Ohsawa, T., Tsukahara, K. & Ogura, M. El regulador de respuesta de Bacillus subtilis DegU es un activador directo de la transcripción de pgsB involucrado en la síntesis de ácido γ-poli-glutámico. Biosci. Biotecnología. Bioquímica 73, 2096–2102 (2009).

Artículo CAS Google Académico

Osera, C., Amati, G., Calvio, C. & Galizzi, A. SwrAA activa la síntesis de poli-γ-glutamato además del enjambre en Bacillus subtilis. Microbiología 155, 2282–2287 (2009).

Artículo CAS Google Académico

Chan, JM, Guttenplan, SB & Kearns, DB Los defectos en el motor flagelar aumentan la síntesis de poli-γ-glutamato en Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 196, 740–753 (2014).

Artículo Google Académico

Cairns, LS, Marlow, VL, Bissett, E., Ostrowski, A. y Stanley-Wall, NR Una señal mecánica transmitida por el flagelo controla la señalización en Bacillus subtilis. mol. Microbiol. 90, 6–21 (2013).

Artículo CAS Google Académico

Bat, AR et al. Mejora de la supervivencia de las bacterias probióticas utilizando ácido poli-γ-glutámico bacteriano. En t. J. Food Microbiol. 196, 24–31 (2015).

Artículo CAS Google Académico

Tang, B. et al. Producción mejorada de ácido poli-γ-glutámico por especies reactivas de oxígeno inducidas por H2O2 en la fermentación de Bacillus subtilis NX-2. Biotecnología. aplicación. Bioquímica 63, 625–632 (2016).

Artículo CAS Google Académico

Nguyen, SLT, Inaoka, T. & Kimura, K. Producción de ácido poli-γ-glutámico por Bacillus subtilis (natto) en condiciones de alta salinidad. Res. Agrícola Jpn. Trimestral 52, 249–253 (2018).

Artículo Google Académico

Kobayashi, K. Plant methyl salicylate induce respuestas de defensa en la rhizobacterium Bacillus subtilis. Reinar. Microbiol. 17, 1365-1376 (2015).

Artículo CAS Google Académico

Seminara, A. et al. Propagación osmótica de biopelículas de Bacillus subtilis impulsada por una matriz extracelular. Pro. Academia Nacional. ciencia EE. UU. 109, 1116–111121 (2012).

Artículo CAS Google Académico

Ido, N. et al. Biopelículas de Bacillus subtilis caracterizadas como hidrogeles. Información sobre la absorción de agua y la unión de agua en biopelículas. Materia blanda 16, 6180–6190 (2020).

Artículo CAS Google Académico

Srinivasan, S., Kaplan, CN y Mahadevan, L. Una teoría multifase para la propagación de enjambres y películas microbianas. eLife 8, e42697 (2019).

Artículo Google Académico

Yan, J., Nadell, CD, Stone, HA, Wingreen, NS y Bassler, BL La presión osmótica mediada por la matriz extracelular impulsa la expansión del biofilm de Vibrio cholerae y la exclusión de tramposos. Nat. común 8, 1–11 (2017).

Artículo Google Académico

Farrell, FDC, Hallatschek, O., Marenduzzo, D. y Waclaw, B. Crecimiento impulsado mecánicamente de colonias microbianas cuasi bidimensionales. física Rev. Lett. 111, 168101 (2013).

Artículo CAS Google Académico

Volfson, D., Cookson, S., Hasty, J. & Tsimring, LS Ordenación biomecánica de poblaciones de células densas. proc. Academia Nacional. ciencia EE. UU. 105, 15346–15351 (2008).

Artículo Google Académico

Xiong, L. et al. Patrones similares a flores en colonias bacterianas de múltiples especies. eLife 9, e48885 (2020).

Artículo CAS Google Académico

Bihi, I., Baudoin, M., Butler, JE, Faille, C. y Zoueshtiagh, F. Los experimentos inversos de Saffman-Taylor con partículas conducen a inestabilidades de digitación impulsadas por la capilaridad. física Rev. Lett. 117, 034501 (2016).

Artículo Google Académico

Vaccari, L. et al. Películas de bacterias en las interfases. Adv. Ciencia de la interfaz coloidal. 247, 561–572 (2017).

Artículo CAS Google Académico

Srinivasan, S. et al. La producción de matriz y la esporulación en biopelículas de Bacillus subtilis se localizan en frentes de onda que se propagan. Biografía. J. 114, 1490–1498 (2018).

Artículo CAS Google Académico

Stewart, PS & Franklin, MJ Heterogeneidad fisiológica en biopelículas. Nat. Rev. Microbiol. 6, 199–210 (2008).

Artículo CAS Google Académico

Ren, Y. et al. Microambientes heterogéneos emergentes en biopelículas: heterogeneidad de la superficie del sustrato y detección de la fuerza de adhesión bacteriana. FEMS Microbiol. Rev. 42, 259–272 (2018).

Artículo CAS Google Académico

Guttenplan, SB, Blair, KM & Kearns, DB El embrague flagelar epse es bifuncional y se sinergiza con la biosíntesis de eps para promover la formación de biopelículas de Bacillus subtilis. PLoS Genet. 6, e1001243 (2010).

Artículo Google Académico

Yu, Y. et al. Los ácidos poli-γ-glutámicos contribuyen a la formación de biopelículas y la colonización de raíces de plantas en aislamientos ambientales seleccionados de Bacillus subtilis. Frente. Microbiol. 7, 1811 (2016).

Artículo Google Académico

Tinevez, J.-Y. et al. Trackmate: una plataforma abierta y extensible para el seguimiento de partículas individuales. Métodos 115, 80–90 (2017).

Artículo CAS Google Académico

Thielicke, W. & Stamhuis, E. Pivlab: hacia una velocimetría digital de imágenes de partículas fácil de usar, asequible y precisa en matlab. J. Res. Abierta. suave 2, 30 (2014).

Artículo Google Académico

Thielicke, W. & Sonntag, R. Velocimetría de imágenes de partículas para matlab: precisión y algoritmos mejorados en pivlab. J. Res. Abierta. suave 9, 12 (2021).

Artículo Google Académico

Descargar referencias

Agradecemos a M. Porter y F. Davidson por sus útiles comentarios. El trabajo en los laboratorios de NSW y CEM está financiado por el Consejo de Investigación de Ciencias Biológicas y Biotecnología (BBSRC) [BB/P001335/1, BB/R012415/1, BB/T00875X/1].

Centro Nacional de Innovación de Biopelículas, Facultad de Física y Astronomía, Universidad de Edimburgo, Edimburgo, EH9 3FD, Reino Unido

Ryan J. Morris y Cait E. MacPhee

División de Microbiología Molecular, Facultad de Ciencias de la Vida, Universidad de Dundee, Dundee, DD1 5EH, Reino Unido

David Stevenson, Tetyana Sukhodub y Nicola R. Stanley-Wall

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

Experimentos diseñados por RJM, NSW y CEM. RJM y DS realizaron experimentos. TS realizó experimentos y creó cepas bacterianas. RJM, CEM y NSW escribieron y editaron el documento. Todos los autores acordaron la versión final del artículo.

Correspondencia a Ryan J. Morris o Nicola R. Stanley-Wall.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Morris, RJ, Stevenson, D., Sukhodub, T. et al. La extracción de fluidos controlados por densidad y temperatura en una biopelícula bacteriana está determinada por la producción de ácido poli-γ-glutámico. npj Biofilms Microbiomas 8, 98 (2022). https://doi.org/10.1038/s41522-022-00361-5

Descargar cita

Recibido: 04 junio 2021

Aceptado: 29 de noviembre de 2022

Publicado: 17 diciembre 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41522-022-00361-5

Cualquier persona con la que compartas el siguiente enlace podrá leer este contenido:

Lo sentimos, un enlace para compartir no está disponible actualmente para este artículo.

Proporcionado por la iniciativa de intercambio de contenido Springer Nature SharedIt