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Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 18146 (2022) Citar este artículo

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Los biofilms bacterianos son colonias complejas de bacterias adheridas a una superficie estática y/o entre sí. Las biopelículas bacterianas muestran una alta resistencia a los agentes antimicrobianos y pueden causar infecciones nosocomiales potencialmente mortales. A pesar del esfuerzo de la comunidad científica que investiga la formación y el crecimiento de biopelículas bacterianas, la interacción preliminar de las bacterias con una superficie y la subsiguiente formación de biopelículas en etapa temprana aún no está clara. En este estudio, presentamos el monitoreo en tiempo real y sin etiquetas de la interacción de las bacterias Escherichia coli y Pseudomonas aeruginosa con superficies de control de vidrio no tratadas y superficies tratadas con cloruro de benzalconio, un compuesto químico conocido por sus propiedades antimicrobianas. La investigación de prueba de principio se ha realizado en un microscopio óptico invertido estándar que aprovecha el fenómeno óptico de las cáusticas como herramienta para controlar la difusión bacteriana y la adhesión temprana y la viabilidad asociada. El poder de resolución mejorado de la configuración óptica permitió el seguimiento y la caracterización de la dinámica de las bacterias, lo que proporcionó pruebas de la relación entre la dinámica de la adhesión bacteriana y la viabilidad, así como la capacidad de formar una biopelícula. Las bacterias viables adheridas a la superficie exhibieron una notable dinámica de deslizamiento o rotación, mientras que las bacterias muertas por el contacto con la superficie permanecieron estáticas una vez adheridas a la superficie. Esta diferencia en la dinámica permitió la detección temprana de la formación de biopelículas y ofrece el potencial para cuantificar la eficiencia de las superficies y recubrimientos antimicrobianos.

Las biopelículas son comunidades microbianas complejas y dinámicas que colonizan y crecen en las superficies. La transición del estado planctónico individual (célula bacteriana única flotando en solución) a una biopelícula mejora la tolerabilidad de las bacterias a los antibióticos y su crecimiento incluso en condiciones desfavorables1. Dentro de la biopelícula, las bacterias están encerradas en una matriz extracelular de producción propia, que consta de sustancias poliméricas extracelulares (EPS) que, junto con proteínas de unión a carbohidratos, estructuras adhesivas como pili y flagelos y sustancias extracelulares, actúan como un andamio estabilizador para la estructura tridimensional de la biopelícula. Esta estructura proporciona a las bacterias la cantidad adecuada de nutrientes necesarios para favorecer su crecimiento y reproducción, mejorando las interacciones de célula a célula, el intercambio de ADN y protegiendo los componentes de la biopelícula del secado, la depredación y otros agentes dañinos externos2.

Los mecanismos de adhesión bacteriana y formación de biopelículas se rigen por varios factores físicos, químicos y biológicos. La primera fase de la formación de biopelículas se refiere a la unión individual de una sola bacteria a una superficie. Las células bacterianas individuales son transportadas a la superficie ya sea por fuerzas físicas o por una capacidad de locomoción intrínseca. Las bacterias móviles usan estructuras, como flagelos, para acercarse a la superficie, guiadas por respuestas quimiotácticas, aerotácticas o fototácticas. La motilidad promueve tanto la interacción inicial con la superficie como el movimiento a lo largo de ella. Por otro lado, las células inmóviles, son entregadas a la superficie por procesos de difusión y sedimentación o por el flujo del fluido en el que están suspendidas3. Una vez que una bacteria se ha acercado a la superficie, la unión inicial está regulada por: fuerzas de atracción y repulsión, principalmente interacciones de Van der Waals y electrostáticas; las propiedades de la superficie como textura, rugosidad e hidrofobicidad; y, las propiedades de la solución como el pH y la temperatura4. Sin embargo, las bacterias adheridas pueden desprenderse de la superficie y volver a unirse al estado planctónico en un proceso llamado adhesión reversible, como resultado de fuerzas hidrodinámicas, fuerzas repulsivas o en respuesta a la disponibilidad de nutrientes5. Si las condiciones ambientales son favorables, una bacteria se adhiere permanentemente a la superficie y comienza a secretar EPS, estableciendo una unión permanente con la superficie (conocida como adhesión irreversible) y favoreciendo la unión de bacterias adicionales6. Las bacterias adheridas irreversiblemente siguen secretando EPS, formando un micronicho favorable a su supervivencia, su proliferación y su cohesión. La presencia de microcolonias bidimensionales de bacterias que interactúan adheridas a una superficie representa la fase temprana del proceso de formación de biopelículas7. El biofilm bacteriano se desarrolla a partir de una monocapa bidimensional de bacterias adheridas de manera irreversible a una colonia multicapa tridimensional que continúa creciendo, proyectándose en el medio circundante por cientos de micrones. Esta estructura de biopelícula actúa como un sistema circulatorio primitivo, conectando las células individuales y permitiendo el intercambio de nutrientes y la eliminación de desechos. En esta etapa final, la biopelícula finalmente se rompe por la presión causada por el número cada vez mayor de bacterias o por la acción de fuerzas externas, como el cizallamiento de fluidos o la abrasión. A continuación, las bacterias se dispersan de nuevo en el medio circundante, pudiendo colonizar e infectar un nuevo sustrato (Fig. 1)8.

Representación esquemática de las cinco etapas de formación de biopelículas8.

Las biopelículas bacterianas representan hasta el 80 % de las infecciones nosocomiales en los EE. UU. y, debido a su adaptabilidad y mayor resistencia a los antibióticos, las biopelículas bacterianas pueden formarse fácilmente en dispositivos médicos y tejidos humanos, lo que provoca infecciones crónicas y potencialmente mortales9. Por lo tanto, las metodologías para prevenir la formación de biopelículas o activar el sistema inmunológico para erradicar estas comunidades son vitales para el control efectivo de las enfermedades relacionadas con biopelículas.

Anteriormente se han investigado varias estrategias para prevenir la formación de biopelículas bacterianas y la posterior infección, con el desarrollo de una gama de las denominadas superficies antimicrobianas. La mayoría de estas superficies están diseñadas para matar bacterias por contacto o proximidad mediante la liberación de sustancias antimicrobianas (superficies biocidas)10.

A pesar de los esfuerzos significativos para caracterizar y prevenir la formación de biopelículas y debido a la variedad de fuerzas involucradas, se necesita una comprensión clara de la interacción bacteria-superficie preliminar y la subsiguiente formación de biopelículas en etapa temprana para desarrollar estrategias antimicrobianas efectivas y apoyar su traducción en -vivo y escenarios de la vida real. En este estudio, hemos monitoreado en tiempo real la dinámica y las interacciones superficiales de las bacterias E. coli y P. aeruginosa expuestas a superficies de vidrio, con o sin recubrimiento antimicrobiano, sin etiquetar las bacterias. E. coli es una bacteria Gram-negativa, con forma de bastoncillo, no esporulante, considerada como un organismo modelo para estudios en ingeniería biológica y microbiología industrial. La mayoría de las cepas de E. coli son inofensivas para el cuerpo humano y se encuentran en el intestino de los organismos de sangre caliente. Sin embargo, varias cepas de E. coli son patógenas y responsables de infecciones en diversos dispositivos médicos, como catéteres uretrales e intravasculares, prótesis articulares, derivaciones e injertos11. La biopelícula de E. coli también puede ser responsable de infecciones de la piel y los tejidos blandos12. P. aeruginosa es una bacteria Gram negativa, en forma de bastoncillo, asporógena y monoflagelada, conocida por causar infecciones graves en pacientes con cáncer inmunocomprometidos y pacientes con quemaduras graves y fibrosis quística13.

La obtención de imágenes de bacterias se realiza comúnmente mediante microscopía de fluorescencia porque mejora el bajo poder de resolución y el bajo contraste que se pueden lograr con la microscopía de campo claro común. Sin embargo, dadas las limitaciones de la microscopía de fluorescencia, incluido el fotoblanqueo y la fototoxicidad, y la falta de conocimiento sobre el efecto en las funciones y procesos bacterianos causados ​​por la exposición a colorantes fluorescentes, se han desarrollado estrategias para realizar un seguimiento sin etiqueta de las células bacterianas y sus adhesión inicial a una superficie. Entre otras técnicas, la microscopía de contraste de fase es una de las técnicas ópticas sin etiquetas más efectivas en términos de resolución y contraste de la imagen adquirida, permitiendo el seguimiento tridimensional de una célula bacteriana en entornos simples y complejos14. Sin embargo, la microscopía de contraste de fase requiere una configuración óptica especializada y costosa, equipada con un condensador específico con un anillo condensador acoplado con objetivos caracterizados por la presencia de placas de fase responsables del retardo de los rayos difractados15. Otra técnica óptica complementaria a la microscopía de contraste de fase, y capaz de producir imágenes de alto contraste de organismos biológicos, es la microscopía de contraste de interferencia diferencial. La alta resolución y el contraste se logran mediante el uso de dos haces coherentes que interfieren. La técnica es capaz de visualizar células humanas16 y bacterianas17; sin embargo, requiere una configuración óptica especializada y costosa, equipada con una serie de polarizadores y prismas.

En este estudio, las imágenes se han realizado generando firmas cáusticas de poblaciones de bacterias, lo que permite monitorearlas en un microscopio óptico invertido común con solo algunos ajustes simples y sin ningún requisito de etiquetado fluorescente. El alto poder de resolución de la configuración óptica basada en cáusticos permitió la caracterización cualitativa de la dinámica de las bacterias E. coli y P. aeruginosa y la detección de interacciones bacterias-superficie preliminares, proporcionando información en tiempo real sobre las bacterias que forman una biopelícula y proliferan en la superficie objetivo.

El objetivo del estudio fue investigar el mecanismo de unión de las bacterias a las superficies y caracterizar cualitativamente la relación potencial entre la dinámica exhibida por las bacterias cuando interactúan con la superficie y su viabilidad o capacidad para formar una biopelícula. Los resultados proporcionan evidencia de las relaciones entre la dinámica de las bacterias y la formación de una biopelícula que tiene implicaciones directas para la caracterización de la eficiencia de las superficies antimicrobianas, así como para la evaluación de la formación de biopelículas en etapas tempranas. La tecnología descrita y empleada en este estudio se puede utilizar para generar datos en forma de imágenes en tiempo real y, por lo tanto, facilitar estudios rentables sin etiquetas de la eficiencia de las superficies antimicrobianas in vitro.

Se han realizado imágenes bacterianas en la cepa no móvil E. coli ATCC 10536 y en la cepa móvil P. aeruginosa ATCC 15442. Ambas cepas se usan comúnmente para investigaciones antimicrobianas. Los cultivos de bacterias durante la noche se diluyeron a McFarland Standard 0,5 en caldo Luria-Bertani (LB) o solución salina tamponada con fosfato (1x PBS, pH 7,4) según fuera apropiado para obtener una concentración de trabajo de aproximadamente 108 CFU/mL. Las bacterias se diluyeron en PBS puro o en una solución de LB al 10 % v/v en PBS. La cantidad de LB se limitó a una concentración máxima del 10 % v/v para limitar el crecimiento y la capacidad de proliferación de las bacterias, lo que permitió tiempos de seguimiento más prolongados para la interacción entre una sola bacteria y la superficie objetivo y la formación de la biopelícula. El límite bajo de LB también minimizó las firmas cáusticas generadas por los nutrientes en el medio (por ejemplo, consulte la Fig. 1 en el material complementario). La dinámica e interacciones bacterianas se monitorearon en un microscopio óptico invertido estándar (Axio Observer.Z1 m, Carl Zeiss), montado sobre pies antivibración (VIBe, Newport) para aislar la muestra del medio ambiente, utilizando 60 μl de solución bacteriana en una cavidad profunda. (250 ± 10 μm de profundidad) en portaobjetos de microscopía. El microscopio estaba equipado con una cámara monocromática (AxioCam ICm1, Carl Zeiss) para adquirir imágenes y grabar vídeos a hasta 30 fps y con un sistema de incubación de platina (Incubadora PM S1, Elemento calefactor P S1, Módulo de temperatura y CO2 S1, Carl Zeiss) para controlar la temperatura y la cantidad de CO2 presente durante los experimentos. El poder de resolución de la configuración óptica se incrementó haciendo algunos ajustes simples a la configuración normal del microscopio siguiendo el procedimiento descrito por Patterson y Whelan para generar firmas cáusticas de las bacterias18. Las firmas ópticas cáusticas facilitaron el reconocimiento de la morfología estructural de las bacterias y la identificación de bacterias individuales y grupos de bacterias, así como la dinámica de sus interacciones. La microscopía electrónica de barrido requiere el secado y la fijación de la población de bacterias que detiene las interacciones dinámicas, por lo tanto, para validar las firmas cáusticas sin etiquetas asociadas con bacterias en solución y adheridas a la superficie, se adquirieron imágenes de fluorescencia de bacterias expuestas a superficies de vidrio de control. con la misma configuración óptica utilizando una fuente de luz fluorescente. Las bacterias E. coli se tiñeron con los tintes fluorescentes SYTO9 y yoduro de propidio (PI) del kit LIVE/DEAD BacLight (Invitrogen), un conocido kit de fluorescencia utilizado para evaluar la viabilidad de las bacterias en solución. SYTO 9 es una tinción de ácido nucleico fluorescente verde capaz de penetrar la membrana de bacterias grampositivas y gramnegativas vivas y muertas, mientras que PI es una tinción cromosómica y nuclear fluorescente roja que es permeable a las células bacterianas con la membrana rota19.

El kit LIVE/DEAD BacLight consta de dos componentes:

Componente A: colorante SYTO 9, colorante 1,67 mM/PI, solución de 300 µL 1,67 mM en DMSO

Componente B: colorante SYTO 9, colorante 1,67 mM/PI, solución de 300 µl 18,3 mM en DMSO

Como ambos componentes del kit consisten en colorantes SYTO 9 y PI al mismo tiempo, decidimos utilizar un fluorocromo diferente, el azul de tripano, para teñir la población de bacterias expuesta a superficies recubiertas con cloruro de benzalconio (BKC). El azul de tripano tiñe selectivamente solo las células bacterianas con membranas rotas, lo que permitió identificar las células muertas.

La eficacia de BKC como agente antimicrobiano y su efecto sobre la interacción bacteria-superficie se probó esparciendo una solución al 0,1 % de BKC en agua desionizada sobre algunas superficies de vidrio. Las superficies tratadas con BKC se dejaron durante 2 h, para permitir la evaporación completa de la solución de BKC y la deposición de la película de BKC, antes de exponerles las soluciones de bacterias.

La dinámica de las bacterias y sus interacciones con las superficies se evaluaron durante un período de tiempo de 20 s utilizando el complemento ImageJ Trackmate, que proporcionó una forma de segmentar automáticamente puntos u objetos aproximadamente esféricos de una imagen 2D o 3D y rastrearlos a lo largo del tiempo20.

La capacidad de formación de imágenes de la configuración óptica utilizada en este estudio para visualizar bacterias se validó frente a la microscopía de fluorescencia mediante la captura de imágenes consecutivas de la misma región de la muestra al cambiar del modo cáustico al modo de fluorescencia, lo que implicó el uso de una fuente de luz diferente. La Figura 2 muestra que no hay una diferencia notable entre las imágenes capturadas en los modos cáustico y de fluorescencia, lo que confirma la capacidad de la técnica cáustica para generar firmas ópticas para todas las bacterias presentes en el campo de visión, lo que permite el monitoreo en tiempo real y caracterización de la dinámica e interacción de las bacterias sin ningún requisito de marcaje fluorescente. Además, el modo cáustico permite obtener imágenes de una mejor definición de la estructura a macroescala de las bacterias.

Comparación entre la misma población de bacterias E. coli fotografiada con un microscopio óptico invertido en modo cáustico (arriba) y modo de fluorescencia (abajo). Las bacterias E. coli se tiñeron con los tintes fluorescentes SYTO9 y yoduro de propidio (PI) del kit LIVE/DEAD BacLight. No hay diferencias significativas entre las dos técnicas de imagen. Las tres bacterias resaltadas por las flechas negras en la imagen de cáusticos no están en la superficie y fueron capturadas cuando se alinearon perpendicularmente a la superficie durante su difusión aleatoria, lo que resultó en una firma óptica casi esférica.

La Figura 3 muestra una comparación entre la firma óptica típica de una bacteria E. coli adherida a la superficie generada usando el modo cáustico y el modo de campo claro. El modo cáustico permite el reconocimiento de los principales componentes estructurales de la bacteria, a saber, la membrana, los nucleoides y los anillos Z entre ellos que sirven como andamio para reclutar las proteínas de división FtsZ y posiblemente inducen fuerzas que constriñen la célula21.

Fotografía de la firma óptica generada por una bacteria E. coli tomada con el microscopio óptico invertido utilizado en esta configuración de trabajo para: (a) modo cáustico; (b) modo de campo claro.

La interacción de la bacteria E. coli con las superficies se investigó caracterizando la dinámica de las bacterias en contacto con la superficie. Se utilizaron controles de vidrio estándar y superficies BKC antimicrobianas para investigar la gama de interacciones bacterias-superficie. Se puede suponer que el vidrio estándar es un control positivo que permite la adhesión bacteriana, mientras que BKC se incorporó como un control negativo que se acepta como antimicrobiano y elimina las bacterias adheridas. Una vez que una bacteria se acerca a la superficie del vidrio, la interacción preliminar está regulada principalmente por interacciones electrostáticas e hidrodinámicas. En nuestro escenario experimental, tanto las bacterias como el vidrio tienen una carga superficial negativa. La membrana externa de E. coli está cargada negativamente debido a la disociación de los grupos carboxilo y fosfato en el peptidoglicano y lipopolisacáridos de las paredes celulares22, mientras que se sabe que el vidrio adquiere carga negativa en contacto con soluciones acuosas, principalmente debido a la disociación de los grupos silanol23:

La fuerza electrostática repulsiva resultante generada por la interacción entre las bacterias y la superficie contrasta con la unión inicial y obliga a las bacterias a difundirse al azar sobre la superficie, exhibiendo un movimiento browniano (Fig. 4a). Sin embargo, debido a las otras fuerzas involucradas, como las fuerzas de Van der Waals (atracción) y las fuerzas gravitatorias, las bacterias pueden superar la repulsión electrostática y adherirse a la superficie. Dependiendo del área superficial de la membrana adherida a la superficie y de la dinámica resultante de la bacteria, es posible distinguir dos tipos de unión: unión rotatoria, cuando solo un extremo de la bacteria se adhiere a la superficie y la bacteria exhibe una unión rotatoria. movimiento alrededor del poste adjunto (Fig. 4b); y unión lateral, cuando la bacteria se adhiere a la superficie en una parte de su longitud y la bacteria exhibe traslación o deslizamiento (Fig. 4c). Se observó la misma dinámica de interacción en bacterias dispersas tanto en LB como en PBS (Figs. S1–S4 del conjunto de datos disponible en línea). Estos tipos de unión han sido investigados experimentalmente recientemente usando microscopía de campo claro por Agladze et al., en un esfuerzo por caracterizar la unión reversible e irreversible de la bacteria E. coli. Los autores concluyeron que la unión lateral es irreversible y que las bacterias que experimentan esta adhesión específica no exhiben ningún movimiento24. Sin embargo, nuestros resultados demuestran que la unión inicial es reversible incluso cuando es lateral. Dependiendo de las fuerzas que actúan sobre las bacterias, el tipo de fijación puede cambiar de rotatorio a lateral y viceversa (Figs. S5–S10 del conjunto de datos disponible en línea). Por lo tanto, debido a la variedad de fuerzas e interacciones involucradas, la distinción entre fijación irreversible y reversible no debe hacerse sobre la base del área de superficie adherida, sino considerando la escala de tiempo de la interacción25. En este estudio, se observó que incluso las bacterias adheridas lateralmente a la superficie no estaban estacionarias y no estaban simplemente adheridas estáticamente a la superficie, sino que mostraban un movimiento deslizante a lo largo de la superficie. En esta etapa, se informa que las bacterias comienzan a secretar sustancias poliméricas extracelulares (EPS)6. La capa de EPS, junto con las atractivas fuerzas de Van der Waals y los pelos de la membrana, fortalecieron la adhesión y expandieron la superficie alrededor de una bacteria que se ve influenciada por su presencia, y actúan como una trampa de nutrientes que facilita la unión de otras bacterias. Por otro lado, las bacterias que entran en contacto con la superficie de vidrio recubierta con BKC simplemente se adhieren estáticamente a la superficie, lo que permite el reconocimiento de bacterias sanas capaces de iniciar una biopelícula a partir de bacterias estáticas y potencialmente muertas (Fig. 4d). Las Figuras 5a, 6 y 7 muestran firmas cáusticas para células expuestas a una superficie recubierta con BKC y que se observaron como estáticas, lo que implica que las células estaban muertas y adheridas a la superficie, lo que se confirmó mediante análisis de fluorescencia con azul de tripano (Fig. 5b) , un colorante capaz de penetrar en las células con membranas rotas26. BKC es un tensioactivo catiónico conocido por sus propiedades antimicrobianas27. Una vez depositado, confiere una carga neta positiva a la superficie, atrayendo la carga negativa de las bacterias y provocando que se adhieran estáticamente una vez que llegan a la superficie (Figs. S11–S13 del conjunto de datos disponible en línea). Además, BKC es capaz de desnaturalizar las proteínas y romper la membrana citoplasmática de las bacterias, provocando su muerte28.

Pistas (líneas amarillas) de las secciones (círculos morados) de cuatro bacterias E. coli que experimentan: (a) difusión aleatoria sobre la superficie; (b) accesorio giratorio; (c) fijación lateral; (d) apego estático. La dinámica de las cuatro bacterias se controló durante aproximadamente 20 s. La longitud de las barras de escala es de 5 μm.

Bacterias E. coli teñidas con azul de tripán y adheridas estáticamente a una superficie BKC fotografiada con un microscopio óptico invertido en modo cáustico (a) y modo de fluorescencia (b).

Fotografía de la firma óptica generada por una bacteria E. coli muerta.

Población de bacterias E. coli muertas dispersas en PBS y expuestas a una superficie de vidrio tratada con BKC durante 1 h. La longitud de la barra de escala es de 20 μm.

El análisis realizado en la bacteria E. coli se replicó en la bacteria P. aeruginosa, para establecer si la motilidad impulsada por flagelos exhibida por la bacteria P. aeruginosa influye en la interacción con la superficie. Los resultados obtenidos sugieren que una vez que se han acercado a la superficie, las bacterias P. aeruginosa interactúan con la superficie exhibiendo el mismo tipo de dinámica observada para las bacterias E. coli no flageladas. La P. aeruginosa adherida a las superficies de control de vidrio no era estática sino que comenzaba a girar alrededor del poste adjunto (accesorio giratorio, Fig. 8a) oa deslizarse a lo largo de la superficie (accesorio lateral, Fig. 8b). Sin embargo, la presencia del flagelo parece mejorar el rango de movimiento de las bacterias adheridas a la superficie, lo que resulta en una rotación o movimiento lateral más evidente a lo largo de la superficie (Figs. S15–S16 del conjunto de datos disponible en línea).

Pistas (líneas rojas) de las secciones (círculos morados) de una bacteria P. aeruginosa: (a) unidas por rotación; (b) unido lateralmente y (c) estático (muerto). Las bacterias muertas se adhirieron estáticamente a la superficie, lo que resultó en la ausencia de huellas perceptibles a lo largo del tiempo. La dinámica de las dos bacterias se controló durante aproximadamente 20 s. La longitud de las barras de escala es de 5 μm.

En cuanto a E. coli, incluso la bacteria P. aeruginosa expuesta a la superficie de vidrio recubierta con BKC se adhirió repentinamente de forma estática a la superficie y no mostró ninguna dinámica durante el período de observación (Fig. 8c, Figs. S17–S18 del conjunto de datos disponible en línea). ).

Es importante observar que el movimiento aleatorio indicativo del movimiento browniano no ocurre en la Fig. 8 y se esperaría para objetos pasivos en una solución. Por lo tanto, parece razonable considerar el movimiento giratorio o lineal de bacterias adheridas a una superficie como indicativo de vida y la ausencia de cualquier movimiento como indicativo de bacterias muertas adheridas a la superficie.

Cuando se exponen a superficies de vidrio sin tratar, después de tan solo 2 h, dos o más bacterias se alinearon e interactuaron entre sí, marcando el inicio de la formación de una colonia bidimensional o la primera etapa de una biopelícula7. Las bacterias se alinearon de forma semiordenada, tratando de minimizar el espacio que las separa y aumentar la superficie de contacto entre ellas (Fig. 9, Figs. S19–S20 del conjunto de datos disponible en línea). Después de 24 h, la concentración de bacterias y el tamaño de las colonias de biopelícula aumentaron proporcionalmente a la cantidad de nutrientes en solución (Figs. 10, 11, 12, 13). Es notable que incluso cuando se desarrolló una colonia tridimensional, aún era posible reconocer la dinámica del sistema (Figs. S21–23 del conjunto de datos disponible en línea). De hecho, incluso en esta etapa de la formación de la biopelícula, las bacterias no eran estáticas sino que continuarían secretando EPS e interactuando dinámicamente con la superficie y entre sí. Por otro lado, las imágenes adquiridas de las bacterias expuestas a las superficies tratadas con BKC demostraron la eficacia del compuesto antimicrobiano para matar las bacterias al contacto, ya que no hubo crecimiento en la población de bacterias y ausencia de formación de biopelícula. con el tiempo (Figs. 14, 15, Fig. S24 del conjunto de datos disponibles en línea).

La bacteria E. coli se agrupa para formar biopelículas.

Población de bacterias E. coli dispersas en PBS y expuestas a una superficie de vidrio durante 24 h. La longitud de la barra de escala es de 20 μm.

Población de bacterias P. aeruginosa dispersada en PBS y expuesta a una superficie de vidrio durante 24 h. La longitud de la barra de escala es de 20 μm.

Población de bacterias E. coli dispersadas en una solución de LB al 10% en PBS y expuestas a una superficie de vidrio durante 24 h. La longitud de la barra de escala es de 20 μm.

Población de bacterias P. aeruginosa dispersas en una solución de LB al 10% en PBS y expuestas a una superficie de vidrio durante 24 h. La longitud de la barra de escala es de 20 μm.

Población de bacterias E. coli muertas dispersas en un PBS y expuestas a una superficie de vidrio tratada con BKC durante 24 h. La longitud de la barra de escala es de 20 μm.

Población de bacterias P. aeruginosa muertas dispersas en un PBS y expuestas a una superficie de vidrio tratada con BKC durante 24 h. La longitud de la barra de escala es de 20 μm.

En este artículo, hemos presentado una caracterización experimental de los mecanismos de unión exhibidos por las bacterias E. coli y P. aeruginosa para controlar superficies de vidrio y superficies de vidrio recubiertas con un agente antimicrobiano. Los resultados demuestran que la viabilidad de las bacterias y su capacidad para formar biopelículas se pueden investigar evaluando su dinámica y sus interacciones con la superficie. Las bacterias sanas adheridas a la superficie de control de vidrio exhibieron un movimiento lateral o giratorio detectable. Por lo tanto, la observación de estos comportamientos permite el reconocimiento temprano de la aparición de un biofilm potencial. Por otro lado, las bacterias muertas se adhirieron estáticamente a las superficies tratadas con BKC, como resultado de la fuerza electrostática de atracción y de la degradación de su membrana externa. Nuestros hallazgos no solo brindan nuevos conocimientos empíricos sobre las interacciones bacteria-superficie en tiempo real, sino que también tienen implicaciones potenciales en las investigaciones de la formación temprana de una biopelícula o de la eficiencia de un recubrimiento antimicrobiano.

Los conjuntos de datos generados y/o analizados durante el presente estudio están disponibles en el repositorio de DataCat en: https://doi.org/10.17638/datacat.liverpool.ac.uk/1631.

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FG agradece la financiación del Consejo de Investigación de Ingeniería y Ciencias Físicas del Reino Unido en forma de una beca de doctorado.

Escuela de Ingeniería, Universidad de Liverpool, Brownlow Hill, Liverpool, L69 3BX, Reino Unido

Francesco Giorgi, Judith M. Curran y Ann A. Patterson

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FG realizó los experimentos bajo la supervisión directa de JMC & EAPFG preparó el primer borrador del manuscrito y todos los autores contribuyeron a la producción de la versión final. Todos los autores han dado su aprobación a la versión final del manuscrito.

Correspondencia a Francesco Giorgi.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Giorgi, F., Curran, JM & Patterson, EA Monitoreo en tiempo real de la dinámica y las interacciones de las bacterias y la formación de biopelículas en etapas tempranas. Informe científico 12, 18146 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-22669-0

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Recibido: 03 Abril 2022

Aceptado: 18 de octubre de 2022

Publicado: 28 de octubre de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-22669-0

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