La combinación de múltiples promotores del crecimiento vegetal y rizobacterias productoras de enzimas hidrolíticas y su efecto en la mejora del crecimiento de la alcachofa de Jerusalén

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 5917 (2023) Citar este artículo

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Las rizobacterias son reconocidas por sus múltiples funciones beneficiosas como promotores clave del desarrollo de las plantas, suprimiendo patógenos y mejorando la salud del suelo. En este estudio, los experimentos se centraron en caracterizar la promoción del crecimiento vegetal (PGP) y los rasgos de producción de hidrolasa extracelular de las rizobacterias, y su impacto en el crecimiento de la alcachofa de Jerusalén. Un total de 50 aislamientos demostraron ser capaces de producir PGP directo o rasgos productores de hidrolasa. Dos cepas prometedoras (Enterobacter cloacae S81 y Pseudomonas azotoformans C2-114) mostraron potencial en la solubilización de fosfato y potasio, producción de IAA y actividad de desaminasa del ácido 1-aminociclopropano-1-carboxílico y producción de hidrolasa. Una cepa productora de hidrolasa (Bacillus subtilis S42) pudo generar celulasa, proteasa, amilasa, β-glucosidasa y fosfatasa. Estas tres cepas seleccionadas también dieron resultados positivos para rasgos indirectos de PGP como sideróforo, amoníaco, oxalato oxidasa, poliamina, exopolisacárido, biopelícula, motilidad y tolerancia a la salinidad y al estrés por sequía. La colonización se observó utilizando un microscopio electrónico de barrido y aparecieron rizobacterias en la superficie de la raíz. Curiosamente, la inoculación con cepas de consorcios (S42, S81 y C2-114) aumentó significativamente todos los parámetros de la planta, incluida la altura, la biomasa, la raíz (longitud, superficie, diámetro y volumen) y el peso fresco del tubérculo. Por lo tanto, recomendamos que los consorcios potenciales de PGP y rizobacterias productoras de hidrolasa se empleen como biofertilizantes para mejorar el suelo y aumentar la productividad de los cultivos.

La alcachofa de Jerusalén, comúnmente conocida como sunchoke (Helianthus tuberosus L.), es uno de los cultivos más rentables debido a la amplia aplicación de su tubérculo1,2. El tubérculo es rico en inulina, un tipo de prebiótico que promueve el crecimiento de microorganismos benéficos en el colon y reduce el colesterol, el azúcar en la sangre y el riesgo de inflamación del colon tanto en humanos como en animales3. En la industria del bioetanol, el tubérculo de sunchoke se considera un material alternativo potencial para la producción de etanol, similar al grano de maíz, la caña de azúcar y la yuca, debido a su rápida cosecha4. Además, las sustancias bioactivas que se encuentran en las hojas y las flores funcionan como antibióticos, antiinflamatorios y antioxidantes1. La planta tiene implicaciones significativas para los sectores agrícola, de producción de alimentos, bioenergético y farmacéutico. En Tailandia, se desarrollaron con éxito varios genotipos en plantaciones adecuadas para alto rendimiento5,6. Sin embargo, la alta productividad de este cultivo se ve favorecida por la utilización de altas dosis de fertilizantes sintéticos1. El uso de fertilizantes químicos provoca un desequilibrio de nutrientes en los suelos y conduce a la contaminación ambiental1,7. Por lo tanto, es crucial lograr prácticas agrícolas sostenibles y proteger el ecosistema de daños.

La aplicación de microbios útiles es un método ecológico que facilita la productividad de los cultivos y el mantenimiento del suelo. Los microbios beneficiosos tienen dos estrategias para la promoción directa e indirecta de la productividad de las plantas, respectivamente, la promoción del crecimiento de las plantas (PGP) y la supresión de fitopatógenos8. Los microorganismos promotores del crecimiento de las plantas (PGPM) desempeñan un papel en la mejora del crecimiento de las plantas con varias características reconocidas: fijación de gas nitrógeno; proporcionar formas inorgánicas solubles de fosfato, potasio, cina y silicio; y la síntesis de hormonas vegetales como la citoquinina, la giberelina y el ácido indol-3-acético (IAA)8 que tienen fuertes efectos sobre la superficie y la elongación de las raíces9. PGPM puede producir actividad desaminasa del ácido 1-aminociclopropano-1-carboxílico (ACC) que disminuye los niveles de etileno, lo que ayuda a las plantas a tolerar los factores estresantes bióticos y abióticos10. Además, varios mecanismos indirectos, incluida la oxidación de azufre y la producción de moléculas de señal de bacteria a planta (es decir, oligosacáridos, péptidos), contribuyen a las características de promoción del crecimiento de las rizobacterias PGP en las plantas11. La hidrolasa liberada por las rizobacterias PGP tiene funciones multifacéticas; no solo suprime los patógenos, sino que también degrada la materia orgánica y hace circular los nutrientes del suelo en la zona de la rizosfera12,13,14. Las hidrolasas como la celulasa, la proteasa y la amilasa de bacterias son catalizadores más efectivos12,13. La celulasa, la amilasa y la β-glucosidasa están vinculadas a la rotación del carbono orgánico cíclico, que las plantas y los microorganismos utilizan como fuente de alimento. La enzima celulasa transforma la celulosa de la materia orgánica en celobiosa, glucosa y oligosacárido15. La amilasa convierte el almidón en oligosacáridos y maltosa, mientras que la β-glucosidasa convierte la celobiosa en glucosa. La β-glucosidasa y la fosfatasa se emplean como indicadores de la calidad del suelo15. La salud del suelo puede depender de estas funciones expresadas a partir de las capacidades de los microbios en el suelo. Por lo tanto, es importante encontrar una bacteria PGP novedosa que pueda usarse como bioinoculante con múltiples características para inoculantes potenciales en el desarrollo de la mejora del crecimiento de las plantas, el biocontrol y la restauración del suelo.

Algunos estudios han descrito el potencial de los microbios PGP aislados del tejido del sunchoke y del suelo de la rizosfera. Por ejemplo, Bacillus sp. Sunchoke estimulado en crecimiento y rendimiento en cultivo de agua limitada3,16. Exserohilum rostratum, un nuevo endófito fúngico efectivo también fue informado por Khaekhum et al.2. Suebrasri et al.17 descubrieron que nuevos endófitos con metabolitos fungicidas suprimen la enfermedad del esclerocio. Por lo tanto, la rizosfera y los tejidos del sunchoke sirven como un grupo de microorganismos beneficiosos para identificar posibles cepas ampliamente aplicables a la productividad de los cultivos. Por lo tanto, clasificamos las cepas efectivas que realizan las siguientes funciones: (i) producir rasgos de PGP in vitro y/o producción de hidrolasa; (ii) colonizar raíces de sunchoke; (iii) mejorar el crecimiento de la alcachofa de Jerusalén. Hasta donde sabemos, no ha habido informes previos sobre las actividades de la enzima hidrolasa de las rizobacterias aisladas de la alcachofa de Jerusalén y sus efectos de promoción del crecimiento. Este estudio tuvo como objetivo caracterizar las rizobacterias en las actividades potenciales de promoción del crecimiento vegetal y producción de enzimas hidrolíticas. Las muestras se aislaron de la rizósfera de la variedad de alcachofa de Jerusalén HEL65 y se evaluaron en un experimento de maceta para determinar un posible efecto sinérgico de las rizobacterias PGP y las rizobacterias productoras de enzimas hidrolíticas para mejorar el crecimiento de la alcachofa de Jerusalén. Presumimos que la aplicación de rizobacterias PGP con actividades multifuncionales podría tener impactos positivos en el crecimiento de las plantas.

Se seleccionaron un total de 50 rizobacterias que constaban de 23 aislamientos del medio extraído del suelo y 27 aislamientos se aislaron del medio R2A. Cada uno de ellos mostró al menos un rasgo PGP o un rasgo productor de enzimas extracelulares (que se muestra en la Tabla 1). Veintiséis aislamientos (52%) produjeron ACC desaminasa, mientras que 14 aislamientos (28%) mostraron producción de IAA. Se encontró solubilización de fosfato y potasio en 22 (44%) y 24 (48%) de los aislados, respectivamente. Con respecto a la prueba de producción de hidrolasa, nuestros hallazgos revelaron que la mayoría de los aislamientos (56%) liberaron β-glucosidasa. Veintidós aislamientos o el 44% poseían enzimas celulolíticas y proteolíticas con zona clara. Pseudomonas azotoformans C2-114 reveló actividades de β-glucosidasa y ureasa.

Los resultados mostraron que los aislamientos S81, R15 y R72 mostraron todos los rasgos directos de PGP, incluida la fijación de nitrógeno, la solubilización de fosfato y potasio, la producción de IAA y la ACC desaminasa. Los aislados de PGP también revelaron la actividad de una o dos hidrolasas. De acuerdo con los resultados de la actividad productora de hidrolasa, tres aislamientos, S12, S42 y S51, exhibieron múltiples rasgos de producción de enzimas que incluyeron celulasa, proteasa, amilasa, β-glucosidasa y fosfatasa. Seleccionamos S42 para un estudio adicional debido a que tiene niveles significativamente más altos de actividades de celulasa y amilasa, en comparación con los otros aislados.

Aislados de rizobacterias que obtuvieron actividades de PGP y P. azotoformans C2-114 que se utilizaron en este estudio y realizaron el ensayo cuantitativo de las actividades de PGP. Se encontró que P. azotoformans C2-114 mostró el resultado positivo para todas las características directas de PGP (Fig. 1). Veintidós cepas fueron capaces de disolver fosfato inorgánico en el sobrenadante. La cepa C2-114 demostró el mayor contenido de fósforo disponible (49,68 µg mL−1), que fue significativamente diferente (p < 0,05) de otros aislados. Además, se midió el potasio máximo disponible (1,28 µg mL−1) en el sobrenadante libre de células de C2-114. Se añadió l-triptófano al medio TSB para producir la hormona IAA. El aislado S81 produjo 13,53 µg mL−1 de IAA, significativamente más que otros aislados. La cantidad de ACC hidrolizado de α-cetobutirato, que era uno de los subproductos derivados de la degradación del sustrato de AAC por la actividad de ACC desaminasa. Encontramos que dos aislamientos, S81 y R83, produjeron los niveles más altos de producción de α-cetobutirato en el rango de 6.64–6.95 mM h−1 mg−1 de proteína. Se eligió S81 porque producía los niveles más altos de ACC desaminasa y actividad de síntesis de IAA, y C2-114 era significativamente capaz de solubilizar fosfato y potasio.

Cuantificación de las actividades de PGP, incluida la solubilización de fosfato (A), solubilización de potasio (B), producción de ácido indol-3-acético (C) y ACC-desaminasa (D) de aislados de PGP. Letras diferentes en las barras representan diferencias significativas (p < 0,05) según la prueba LSD.

Los aislados seleccionados S42 y S81 se identificaron en base a las secuencias del gen 16S rRNA. Las secuencias completas de las bacterias S42 y S81 coincidían con las secuencias disponibles para Bacillus subtilis (100 % de identidad) y Enterobacter cloacae (100 % de identidad), respectivamente. En el análisis filogenético, S42 formó el clado sólido con la cepa de tipo Bacillus subtilis TAVG03T (Fig. 2). En cuanto a S81, se encontró un clado perteneciente a la cepa tipo QsEp A&N 15A7T de Enterobacter cloacae (Fig. 2).

El árbol filogenético basado en secuencias de nucleótidos de ADNr 16S de S81 (A) y S42 (B) se construyó utilizando Neighbor-Joining con 1000 réplicas de bootstrap. El valor de arranque se presenta en los nodos. Se utilizó la máxima verosimilitud para calcular la distancia evolutiva.

S42, S81 y C2-114 se examinaron en busca de otras capacidades de PGP: motilidad y tolerancia a concentraciones de NaCl y PEG (Tabla 2). S42 inhibió el crecimiento de S. rolfsii, mientras que los otros dos aislamientos de PGP fueron incapaces de antagonizar patógenos. S81 y C2-114 demostraron múltiples acciones, incluida la producción de sideróforo y amoníaco, oxalato oxidasa y síntesis de poliamina. Tres cepas demostraron ser capaces de producir EPS y biofilm. C2-114 presentó mayor tolerancia a estreses abióticos como sales, sequía y alta temperatura. S42, S81 y C2-114 eran capaces de motilidad, y S42 mostraba el diámetro más grande entre los examinados. Hubo evidencia de que todas las cepas seleccionadas poseen características indirectas de PGP y tolerancia abiótica. El microscopio electrónico de barrido (SEM) reveló la efectividad de la colonización de las raíces de alcachofa de Jerusalén (Fig. 3). Nuestros resultados mostraron que la superficie de la raíz fue colonizada por células bacterianas. Se distribuyeron células de tres cepas en la vecindad de la superficie rugosa epidérmica.

Micrografía electrónica de barrido de raíces de alcachofa de Jerusalén. Las celdas agrupadas se presentan con puntas de flecha blancas. (A) Control, (B) planta inoculada con B. subtilis S42, (C) planta inoculada con E. cloacae S81, (D) planta inoculada con P. azotoformans C2-114.

Se examinó la biocompatibilidad de aislados seleccionados como S42, S81 y C2-114. Los resultados no revelaron una zona de inhibición del crecimiento en las líneas de intersección. Este hallazgo indicó que los aislamientos podrían mezclarse para la inoculación de plantas. La tasa de fotosíntesis (Pn), la conductancia estomática (Sc) y la tasa de transpiración (Tr) se monitorearon a los 30, 60 y 90 DDT para evaluar los efectos de las bacterias PGP (Fig. 4). Hubo una reducción en la tasa fotosintética, la conductancia estomática y la tasa de transpiración tanto en el tratamiento con bacterias como en el no tratado. Los aislados seleccionados tuvieron diferentes efectos sobre la altura de la planta y el peso fresco de los tubérculos (Fig. 5). Los tratamientos del consorcio (S42, S81, C2-114) aumentaron significativamente (p < 0,05) la altura de la planta (11,6 %), el peso seco de los brotes (10,8 %), el peso seco de las raíces (63,8 %) y la biomasa (24,4 %) (Fig. 6) en comparación con el control. El tratamiento con inóculo único (S81 y C2-114) tuvo el efecto de aumentar la altura de la planta y la biomasa a los 60 DDT hasta el momento de la cosecha. Sin embargo, S81 y C2-114 no produjeron ninguna mejora en la longitud de la raíz y la superficie de la raíz, mientras que los inóculos mixtos afectaron positivamente la longitud de la raíz, el diámetro de la raíz, la superficie de la raíz y el volumen de la raíz (Fig. 7). Además, el tratamiento consorcio incrementó significativamente el peso fresco del tubérculo en un 24,2%.

Efecto de la inoculación bacteriana sobre los parámetros de la fotosíntesis, incluida la tasa fotosintética (A), la conductancia estomática (B) y la tasa de transpiración (C). W: planta sin inocular como control, S4: B. subtilis S42, S8: E. cloacae S81, C2: P. azotoformans C2-114, S4S8: coinoculación B. subtilis S42 y E. cloacae S81, S4C2: coinoculación B. subtilis S42 y P. azotoformans C2-114, S4S8C2: mezcla de todas las cepas.

Efecto de la inoculación bacteriana sobre la altura de la planta (A) y el peso fresco del tubérculo (B). Letras diferentes representan diferencias significativas (p < 0,05) según la prueba LSD. W: planta sin inocular como control, S4: B. subtilis S42, S8: E. cloacae S81, C2: P. azotoformans C2-114, S4S8: coinoculación B. subtilis S42 y E. cloacae S81, S4C2: coinoculación B. subtilis S42 y P. azotoformans C2-114, S4S8C2: mezcla de todas las cepas.

Efecto de la inoculación bacteriana sobre el peso seco de los brotes (A), el peso seco de las raíces (B) y la biomasa (C). Letras diferentes representan diferencias significativas (p < 0,05) según la prueba LSD. W: planta sin inocular como control, S4: B. subtilis S42, S8: E. cloacae S81, C2: P. azotoformans C2-114, S4S8: coinoculación B. subtilis S42 y E. cloacae S81, S4C2: coinoculación B. subtilis S42 y P. azotoformans C2-114, S4S8C2: mezcla de todas las cepas.

Efecto de la inoculación bacteriana sobre la longitud de la raíz, la superficie de la raíz, el diámetro de la raíz y el volumen de la raíz. Letras diferentes representan diferencias significativas (p < 0,05) según la prueba LSD. W: planta sin inocular como control, S4: B. subtilis S42, S8: E. cloacae S81, C2: P. azotoformans C2-114, S4S8: coinoculación B. subtilis S42 y E. cloacae S81, S4C2: coinoculación B. subtilis S42 y P. azotoformans C2-114, S4S8C2: mezcla de todas las cepas.

Las rizobacterias que poseen múltiples rasgos de PGP se pueden utilizar para aplicaciones agrícolas.

El objetivo de este trabajo fue examinar rizobacterias con una variedad de propiedades PGP directas e indirectas para estimular el crecimiento de la alcachofa de Jerusalén. Los datos sugirieron que los aislados del consorcio PGP (S42, S81 y C2-114) habían aumentado significativamente el desarrollo de la alcachofa de Jerusalén al mejorar la biomasa de la planta y el peso fresco del tubérculo.

Curiosamente, de acuerdo con nuestra observación de las propiedades de PGP y enzimas, algunos aislados de PGP poseían rasgos multifuncionales directos de PGP, pero no se encontraron consistentemente todas las producciones de hidrolasa de rasgos indirectos de PGP. Es posible que algunas bacterias no requieran necesariamente la producción de la enzima para sintetizar los nutrientes. Sin embargo, según nuestro mejor conocimiento, las características comunes de PGP y enzima hidrolítica de las bacterias aisladas de la rizósfera de la alcachofa de Jerusalén fueron reconocidas y examinadas por primera vez. Los aislados de rizobacterias produjeron producción de hidrolasa, incluidas las enzimas celulasa, β-glucosidasa, proteasa, fosfatasa y ureasa. Estas enzimas desempeñaron un papel importante en el ciclo C, el ciclo N y el ciclo P en los suelos. La celulosa es el componente más abundante de las enmiendas orgánicas. Es un precursor principal para la síntesis de materia orgánica y carbono orgánico15,18. Además, estas enzimas también pueden hidrolizar las paredes celulares de los patógenos para proteger las plantas huésped2. Nuestros resultados coincidieron con los de El-Deeb et al.19, Hazarika et al.14 y Magotra et al.20, quienes informaron que Bacillus exhibió los niveles más altos de actividades de enzimas hidrolíticas que podrían usarse para caracterizar candidatos a PGP12,14,19,20, 21,22,23,24.

La raíz de la planta absorbe fósforo y potasio en forma soluble para ser utilizados en el crecimiento14,25. Nuestros hallazgos en este estudio sugieren que muchos aislados podrían solubilizar tanto el fosfato inorgánico como el potasio. La capacidad de las bacterias para solubilizar fosfato y potasio se demostró por su utilización y conversión de azúcar en ácido orgánico, lo que redujo el pH de los medios26,27,28. Además, varios estudios encontraron que las bacterias productoras de EPS podían soportar la alta eficiencia de solubilización27,28. Nuestro aislado C2-114 mostró la capacidad de producir EPS, lo que indica que el EPS mejora la eficiencia de la solubilización inorgánica. Además, es posible que el solubilizante de P y K libere fuentes de zinc y silicato a través de los mismos mecanismos22,23,28.

IAA tiene un efecto directo sobre el alargamiento de la raíz y un efecto indirecto sobre la mejora de la eficiencia de absorción de agua y nutrientes28, respectivamente. La excreción de IAA en suelos difiere de la in vitro, dependiendo de varios factores. En un estudio previo de Sritongon et al.29, la misma cepa de P. azotoformans produjo 78,75 µg mL−1 de IAA en presencia de l-triptófano. Sin embargo, las cantidades variables de IAA in vitro dependen de varios factores, incluidas las condiciones de cultivo, las cepas de las especies y las concentraciones de triptófano30. E. cloacae produjo la mayor cantidad de IAA. Nuestros resultados concuerdan con el estudio de Kavamura et al.12, que reveló altas concentraciones de AIA producidas por miembros de la familia Enterobacteriaceae.

El crecimiento de las plantas está regulado por la interacción entre los niveles de IAA y ACC16,31. Nuestros hallazgos sugieren que S81 produce la mayor cantidad de IAA y ACC desaminasa. La alta concentración de IAA en las raíces de las plantas influye en el precursor de ACC, lo que resulta en la formación de un aumento de etileno31. El exceso de etileno es la señal desencadenante con la que se inhibe el crecimiento de las plantas. Las ACC desaminasas que son producidas por las rizobacterias PGP hidrolizan el precursor de etileno en α-cetobutirato y amoníaco para disminuir el etileno31,32,33 En condiciones normales y con limitación de agua, tanto IAA como ACC desaminasas como señal aumentan particularmente la longitud, el diámetro y el volumen de raíz de sunchoke16. De acuerdo con la investigación de Khan et al.34, tanto la IAA como la ACC desaminasa mostraron que el efecto sobre el aumento de la biomasa vegetal puede aumentar la biomasa vegetal. La ACC desaminasa mostró una actividad sobresaliente sobre otras en condiciones de estrés. Sin embargo, en condiciones normales, la actividad de la ACC desaminasa fue mayor que en condiciones de estrés35. Se requirió ACC desaminasa para que las rizobacterias PGP promovieran de manera eficiente el desarrollo de la planta en ambas condiciones.

Se examinaron tres cepas (S42, S81 y C2-114) en busca de diversas acciones que podrían promover indirectamente la planta. Presentaron resultados positivos para la secreción de oxalato oxidasa, que conduce a la destrucción de fitopatógenos como Sclerotinia sclerotiorum y Sclerotium rolfsii36. S81 y C2-114 produjeron el sideróforo, un quelante que elimina el férrico en el suelo ambiental. El hierro es un cofactor necesario para las enzimas metabólicas, lo que provoca una competencia que suprime el crecimiento de patógenos de plantas37. Sin embargo, no encontramos una interacción entre el sideróforo y la inhibición del crecimiento de S. rolfsii. S42 reveló una inhibición positiva de S. rolfsii, que puede haber sido causada por proteasa celulasa, amilasa u otra hidrolasa, además de compuestos bioactivos. Las enzimas producidas fueron parte de un papel desencadenante para proteger la planta huésped. Además, las hidrolasas rompen las paredes celulares de hongos patógenos de plantas que infectan la alcachofa de Jerusalén; estos patógenos incluyen Fusarium oxysporum, Colletotrichum capsici y S. rolfsii2,17.

Dos cepas de PGP dieron un resultado positivo de producción de poliamina. La poliamina (putrescina, espermidina y espermina) mejora el desarrollo de las plantas. Además, alivia las plantas en ambientes adversos como toxicidad de metales, oxidación, sequía, salinidad y frío38. Tres cepas fueron capaces de producir EPS y biopelícula. Retienen la humedad en la superficie de sus células para ocupar y proteger la superficie de la raíz de la deshidratación, reduciendo así los impactos de la sequedad, la salinidad y la temperatura variables12. Bacilo ap. y Pantoea sp. fueron los productores de EPS más prolíficos12,16,23. El biofilm microbiano aumenta la eficacia de la conexión microbio-raíz14,23,24,39, reduce la infección por patógenos vegetales y defiende a las plantas del estrés23,39. Se demostró que nuestras cepas selectivas podían sobrevivir a las presiones ambientales como las altas temperaturas, la sal y la sequía. Los microbios emplearon celulasa y pectinasa para hidrolizar la pared celular de la raíz y colonizar las puntas de las raíces y las ramas de las raíces en el interior y el exterior de las raíces19,30. Nuestros hallazgos también mostraron que tres cepas mostraron motilidad, como nadar, enjambrar y contraerse. Por lo tanto, las cepas seleccionadas son candidatas a cepas que poseen múltiples funciones en PGP, colonización y supervivencia en suelos ambientales.

La actividad de las rizobacterias PGP en el suelo no está impulsada por una sola especie sino por numerosas especies que operan simultáneamente12,40. La ausencia de una zona inhibidora en la intersección de las rayas perpendiculares indicó que la cepa productora de hidrolasa y las cepas PGP eran compatibles. Fue posible combinar cepas y usarlas para promover el crecimiento de la alcachofa de Jerusalén. Por lo tanto, se realizaron en un suelo no estéril, lo que significa que su rendimiento puede diferir del exhibido in vitro.

De acuerdo con los resultados fisiológicos de la planta, la tasa fotosintética, la conductancia estomática y la tasa de transpiración mostraron tendencias decrecientes de 30 a 90 DDT. La conductancia estomática y la transpiración respondieron a la prevención de la pérdida de agua en situaciones de déficit hídrico6. Se observaron diferencias significativas en la tasa fotosintética durante el estrés por sequía1,16. Estos parámetros indicaron respuestas variables al estrés.

En este caso, la altura de la planta, la masa seca aérea, la masa seca de la raíz y la biomasa total se incrementaron cuando se trató con un solo inoculante del aislado bacteriano C2-114. De manera similar, según Sritongon et al.29, C2-114 aumentó en la biomasa de suchoke en el crecimiento inicial, lo que mostró una fuerte correlación con IAA. Además, la mayor elongación, diámetro y superficie de la raíz se consideraron efectos positivos de la inoculación de S81 y C2-114. Esto puede ser el resultado de la presencia de IAA y ACC desaminasa. ACC e IAA cooperaron para modular la proporción de ACC a IAA en sistemas de raíz modificados16,27,34.

El consorcio de aislados seleccionados reveló una diferencia significativa en su capacidad para aumentar la altura, el peso seco de la parte aérea, el peso seco de la raíz, la biomasa a los 60 DDT a la cosecha y el peso fresco del tubérculo. Al igual que Hazarika et al.14, los consorcios de rizobacterias PGP tuvieron más efecto en las plantas que el inóculo individual. Los consorcios de aislados bacterianos aliviaron el efecto negativo del estrés por salinidad y aumentaron la biomasa del frijol francés27. Nuestros datos indican que el cultivo mixto parece contribuir a la actividad sinérgica al mejorar la alcachofa de Jerusalén. Por lo tanto, un consorcio de PGP (dos cepas) y rizobacterias productoras de hidrolasa podría mejorar la biomasa vegetal y la productividad de los tubérculos mejor que un solo inoculante a través de múltiples actividades PGP directas e indirectas, así como la síntesis de enzimas extracelulares. Además, la aplicación del inoculante mixto mostró un mayor número de células de supervivencia en sus ambientes naturales que el uso de un solo inoculante12,16,40,41,42. Se puede utilizar como biofertilizante en sunchoke. Sin embargo, este trabajo tiene limitaciones que los aislamientos potenciales del consorcio deben confirmarse en las condiciones de campo. Para futuras investigaciones, nos centraremos en la eficacia de las enmiendas orgánicas aplicadas en el campo para promover el crecimiento de las plantas para el desarrollo de biofertilizantes.

Nuestro estudio reveló que las rizobacterias poseen actividades directas e indirectas de PGP multifacéticas que respaldan su capacidad para mejorar la productividad de las plantas. Se confirmó que dos cepas PGP (Enterobacter cloacae y Pseudomonas azotoformans) y una cepa productora de hidrolasa (Bacillus subtilis) mejoran el crecimiento de las plantas. Estos interesantes resultados sugirieron que los tres aislados mezclados estimularon el crecimiento de plantas como la biomasa y el tubérculo de la alcachofa de Jerusalén. Por lo tanto, este consorcio demostró un alto potencial para la promoción del crecimiento de las plantas. Para verificar la mejora del suelo; El consorcio de inoculantes se puede utilizar como complemento de la enmienda del suelo o compost y se puede desarrollar como producto biofertilizante y utilizarlo en suelos infértiles para una mejora sostenible.

Se recogieron muestras de raíces de alcachofa de Jerusalén con tierra adherida a una profundidad de 0 a 10 cm en la granja del departamento de cultivo de campo, facultad de agricultura, Universidad de Khon Kaen, Khon Kaen Tailandia (16°47′45′′N, 102°81′07 ''MI). Las raíces se almacenaron en una caja de hielo antes de ser trasladadas al laboratorio. La raíz de cada muestra se cortó en segmentos de aproximadamente 0,5 cm. Se transfirieron cinco gramos de segmentos de raíz a 45 ml de diluyente (0,85 % (p/v) de NaCl y 0,1 % (p/v) de tween 20) en un matraz Erlenmeyer. Todos los matraces se agitaron a 180 rpm durante 1 h. Se esparció una alícuota de 0,0,1 ml de la dilución en serie diez veces en medio de extracto de suelo43: 1,0 g de peptona, 1,0 g de extracto de levadura, 0,5 g de K2HPO4, 0,5 g (NH4)2SO4, 0,05 g de MgSO4 ·7H2O, 0,01 g FeCl3, 0,1 g CaCl2, 15,0 g agar, 250 mL extracto de suelo, 15,0 g agar y 750 mL de agua destilada y medio R2A: 0,5 g caseína hidrolizada, 0,5 g proteosa peptona, 0,5 g glucosa, 0,5 g almidón soluble, 0,3 g de K2HPO4, 0,024 g de MgSO4·7H2O, 0,3 g de piruvato de sodio, 15,0 g de agar y 1000 mL de agua destilada. Las placas se incubaron a 30 °C durante 48 h. Se seleccionaron diferentes colonias bacterianas en función de su morfología y se purificaron mediante la técnica de cross-streaking en una placa de Petri que contenía agar tríptico de soja (TSA) (Himedia). Los aislados bacterianos se almacenaron en una solución de glicerol al 20 % a -20 °C hasta su uso posterior.

Todos los aislamientos fueron examinados para rasgos de PGP tales como fijación de nitrógeno, solubilización de fosfato, solubilización de potasio, síntesis de ácido indol3-acético y actividad desaminasa del ácido 1-aminociclopropano-1-carboxílico (ACC). En cuanto a la fijación de nitrógeno, cada aislamiento se inoculó en caldo libre de nitrógeno de Ashby44. Se utilizaron NBRIP agar45 y Aleksandrov agar46 para evaluar la solubilización de fosfato y potasio, respectivamente. Cada aislado se cultivó en caldo soja tríptico (TSB) (Himedia) suplementado con 1 g L−1 l-triptófano (Acros Organics) durante 24 h, y se le añadió reactivo de Salkowski47. La actividad de ACC desaminasa se examinó en agar de sal mínima DF48 con 3 mM de ácido 1-aminociclopropano-1-carboxílico (ACC) en lugar de sulfato de amonio32. Pseudomonas azotoformans C2-114 (Número de acceso LC130639), que poseía fijación de nitrógeno, solubilización de fosfato y potasio, producción de IAA y rasgos sideróforos29, se utilizó para investigar la actividad de ACC desaminasa y otras actividades de PGP e hidrolasa.

La solubilización de fosfato de cada aislado de PGP se determinó usando medio NBRIP45. El aislado de PGP se cultivó en medio TSB a 30 °C, 150 rpm durante 24 h. La célula bacteriana (que constaba de aproximadamente 108 CFU mL−1 como inóculo (100 µL) de cada aislado se transfirió a un tubo de caldo NBRIP estéril de 5 mL que contenía polvo de fosfato tricálcico al 0,5 % (p/v) como fosfato insoluble. Los tubos se prepararon por triplicado, y se incubaron a 30 °C, 150 rpm durante 7 días, las alícuotas fueron de 1 mL de sobrenadante de cada muestra y control, 1 mL de reactivo molibdato-vanadato 49. Todos los tubos se incubaron en oscuridad durante 20 min. Para la cuantificación del fósforo soluble se utilizó el color amarillo, la muestra se midió a 420 nm (U-5100, Hitachi), se construyó una curva estándar con KH2PO4.

La solubilización de potasio de cada aislado de PGP se determinó usando medio Aleksandrov46. El inóculo (100 µl) se transfirió a 5 ml de caldo Aleksandrov estéril que contenía polvo de silicato de aluminio y potasio al 0,2 % (p/v) (Himedia) como fuente de potasio insoluble. Los tubos se hicieron por triplicado y se incubaron a 30 °C, 150 rpm durante 7 días. El medio de caldo Aleksandrov sin inoculación sirvió como control. El potasio soluble en el sobrenadante se midió a 776,5 nm usando un espectrómetro de absorción atómica (AAnalyst 100, Perkin Elmer) con aire de llama C2H2 y una rendija de 0,7 nm. Se construyó una curva estándar usando KCl.

La producción de AIA de cada aislado de PGP se determinó mediante el reactivo de Salkowski47. Se añadió inóculo (100 µL) de cada aislado en 5 mL de medio TSB estéril suplementado con 1 g L-1 l-triptófano (Acros Organics). Los tubos se hicieron por triplicado y luego se incubaron a 30 °C, 150 rpm durante 48 h. Se mezclaron alícuotas de 1 mL de sobrenadante con 2 mL de reactivo de Salkowski47, antes de ser incubadas en la oscuridad por 30 min. La aparición de coloración roja se utilizó para cuantificar la producción de IAA. La muestra se leyó a 530 nm. Se construyó una curva estándar usando IAA (Acros Organics).

La actividad de la ACC desaminasa se determinó según Penrose y Glick32. Los aislados se cultivaron en 5 mL de medio de caldo mínimo salino DF48 con adición de 3 mM de ACC (Acros Organics), y luego se incubaron a 30 °C, 150 rpm, durante 72 h. La célula se recogió por centrifugación, luego se lavó con Tris-HCl 0,1 M (pH 7,5) y se resuspendió en 600 µl de Tris-HCl 0,1 M (pH 8,5). Se añadió tolueno (30 µl) a la solución celular y se agitó. Para determinar la actividad de la ACC desaminasa, se pipetearon células toluenizadas en una alícuota de 200 µl en un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 ml, mezcladas con 20 µl de ACC 0,5 M y 200 µl de Tris-HCl 0,1 M (pH 8,5). A continuación, la mezcla se incubó a 30 °C durante 30 min. Se añadió 1 ml de HCl 0,56 N, se agitó con vórtex. La alícuota del sobrenadante (1 mL) se mezcló con 800 µL de HCl 0,56 N y 300 µL del reactivo de 2,4 dinitrofenilhidracina al 0,2 % (p/v) (disuelto en HCl 2 N), respectivamente, antes de la incubación a 30 °C. durante 30 min. Luego se añadió 1 ml de NaOH 2 N y se mezcló completamente antes de medirlo a 540 nm. La curva estándar se construyó utilizando α-cetobutirato (Sigma-Aldrich). La proteína soluble se realizó de acuerdo con el ensayo de Bradford50. Para crear una curva de proteína estándar, se utilizó albúmina de suero bovino (Acros Organics).

Todos los aislamientos fueron examinados para rasgos de celulasa, β-glucosidasa, α-amilasa, proteasa, ureasa y fosfatasa. Para la evaluación, se analizaron la celulasa y la β-glucosidasa secretadas en medio mínimo sólido51: 6,8 g Na2HPO4, 3,0 g KH2HPO4, 0,5 g NaCl, 1,3 g (NH4)2SO4, 0,5 g MgSO4·7H2O, 15,0 g de agar, 1000 mL de agua destilada, al que se le añadió 0,5% (p/v) de celulosa para hidrólisis de celulosa y 0,1 mL de 0,04% (p/v) de 4-metilumbeliferil-β-d-glucopiranósido (MUG) (Acros Organics) para esparcir sobre el agar antes de la inoculación. Después de la incubación a 30 °C durante 48 h, se utilizó solución de yodo de Gram para evaluar la hidrólisis de la celulosa. Apareció un halo fluorescente de hidrólisis MUG bajo luz ultravioleta. Para la evaluación de la producción proteolítica, cada aislado fue inoculado en agar leche descremada (Peptona 5 g, extracto de carne 3 g, leche descremada 10 g, agar 15 g—1000 mL). Una zona clara fue visible alrededor de la colonia después de la incubación a 30 °C durante 48 h. Para evaluar la α-amilasa, la producción se realizó en agar de almidón (5 g de peptona, 3 g de extracto de carne, 10 g de almidón, 15 g de agar, 1000 ml). La hidrólisis del almidón se examinó utilizando una solución de yodo de Gram. Para la producción de fosfatasa, el cultivo se colocó en medio TSA que contenía sal tetrasódica de bisfosfato de fenolftaleína al 0,01 % (p/v) (Sigma-Aldrich), y se examinó con hidróxido de amonio al 8,4 % (v/v)26. La producción de ureasa se llevó a cabo en agar de urea medio de Christensen (Himedia) que contenía urea estéril al 2% p/v. Se observó que la colonia mostraba un color rojo rosado en el agar52.

Los aislamientos seleccionados se examinaron en busca de rasgos indirectos de PGP, incluida la producción de sideróforos, la prueba antagónica, la producción de poliaminas, la producción de amoníaco, la producción de la enzima oxalato oxidasa, la biopelícula, la producción de exopolisacáridos y la característica microbiana en condiciones de estrés ambiental. Se utilizó agar Chrome Azurol S (CAS) para evaluar la formación de sideróforos53. La supresión de Sclerotium rolfsii se investigó siguiendo el método dual descrito en Sritongon et al.29. El porcentaje de inhibición se calculó desde el centro hasta el borde de la longitud del micelio fúngico: (A - B)/A × 100 (A: control, B: inoculación bacteriana). Se usó caldo base de descarboxilasa de Moeller (Himedia) pH 7,0 suplementado con clorhidrato de l-arginina al 1% (p/v) (Acros Organics) para ensayar la producción de poliamina. La producción de amoníaco se evaluó utilizando agua peptonada al 4 % (p/v) y se examinó con el reactivo de Nessler54. La oxalato oxidasa se probó en la placa de agar que contenía oxalato de potasio como única fuente de carbono55. El ensayo de motilidad que incluyó natación, enjambre y espasmos se llevó a cabo utilizando un medio nutritivo (0,5 % (p/v) de peptona y 0,3 % (p/v) de extracto de carne) con 0,3 %, 0,5 % y 1,0 % (p/v) ) agar, respectivamente. La producción de biopelículas se realizó mediante tinción con cristal violeta con una versión modificada de Latorre et al.56. La producción de exopolisacárido (EPS) se realizó de acuerdo con Kavamura et al.12 reemplazando la sacarosa con glucosa al 10% (p/v). La capacidad de los aislamientos para tolerar un entorno estresante se probó mediante el cultivo en caldo nutritivo con una concentración variada de NaCl, 20 % (p/v), polietilenglicol (PEG6000) y crecimiento a 40 °C.

Las rizobacterias selectivas se cultivaron en caldo nutritivo en un agitador rotatorio a 150 rpm y 30 °C durante 18 h. El ADN genómico se extrajo según el protocolo del fabricante utilizando el kit de ADN bacteriano TIANAMP (Tiangen biotech, China). El gen 16S rRNA se amplificó con los cebadores universales 8F: 5′ AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG 3′57 y 1512R: 5′ ACG GYT ACC TTG TTA CGA CTT 3′58. La reacción se llevó a cabo en un termociclador FlexCycler2 PCR (Analytik Jena, Alemania) utilizando el siguiente programa: desnaturalización inicial a 95 °C, 10 min; 35 ciclos de desnaturalización a 94 °C, 1 min; recocido a 55 °C, 1 min; extensión a 72 °C, 90 s, y extensión final a 72 °C, 10 min. El producto de la PCR se comprobó en gel de agarosa al 1,5 % (p/v), antes de enviarlo para su purificación y secuenciación a 1st BASE Laboratories Sdn. Bhd., Malasia. Las secuencias de nucleótidos se sometieron al programa BioEdit. Las secuencias completas se analizaron utilizando BLASTN para compararlas con los tipos de cepas en la base de datos GenBank. Se alineó el ClustalW en el programa MEGA 7.0.0 y se construyó un árbol filogenético utilizando el método de unión de vecinos que incluye 1000 réplicas de arranque.

Los genotipos de plántulas de alcachofa de Jerusalén HEL65 se obtuvieron de la Facultad de Agricultura de la Universidad de Khon Kaen. Para la preparación de la planta, se germinó un trozo de tubérculo que tenía de dos a tres yemas de la variedad sunchoke HEL65 en una caja que contenía turba de coco húmeda. Luego, se transfirieron a cascarilla de arroz carbonizada y tierra (1:1 p/p) en una bandeja de plástico con pozos de 4 cm de diámetro y se cultivaron hasta que se expandieron dos hojas verdaderas59. Las plantas se recogieron y lavaron con agua del grifo para eliminar la cáscara de arroz carbonizada y la tierra. Las raíces de las plantas se enjuagaron dos veces con agua destilada esterilizada. El sistema de raíces de cada planta se sumergió suavemente en un tubo de vidrio de 15 ml que contenía 10 ml de agua destilada estéril. Luego, la suspensión bacteriana (consistía en aproximadamente 108 CFU mL-1 del aislado seleccionado) se transfirió al tubo. El tratamiento de control consistió en raíces en agua destilada esterilizada. Todos los tubos se incubaron a temperatura ambiente durante 24 h. Para preparar la muestra para el escaneo electrónico análisis microscópico (SEM), toda la raíz de cada planta se enjuagó dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) estéril 0,1 M (pH 7,2). h, luego se segmentaron entre 3-5 mm y se sumergieron en PBS durante 10 min, tres veces Para deshidratar las muestras, se sumergieron en una serie de diluciones de etanol (50, 60, 70, 80 y 90% v/v) durante 15 min en cada gradiente, y dos veces etanol absoluto a concentración terminal durante 30 min, antes de la eliminación del etanol.Las muestras se secaron con un secador de punto crítico (CPD 7501, Polaron), luego se unieron a tubos de aluminio con cinta de carbón de doble capa y se recubrieron con oro en una máquina de recubrimiento por pulverización catódica (108 auto, Cressington) Se empleó un microscopio electrónico de barrido Leo 1450VP para identificar las cepas que colonizaron en la raíz.

La biocompatibilidad de aislados selectivos se evaluó mediante la técnica de rayado perpendicular41. Cada aislamiento se sembró simultáneamente a través del cultivo central en forma perpendicular en medio TSA. Las placas se incubaron a 30 °C durante 24 h. Los aislados bacterianos pudieron crecer en la intersección de cada cultivo, lo que indica biocompatibilidad.

La mejora del crecimiento de Sunchoke mediante aislamientos de rizobacterias seleccionados se realizó en un invernadero de lados abiertos en el Departamento de Cultivos de Campo, Facultad de Agricultura, Universidad de Khon Kaen, Tailandia (16°47′59′′N, 102°81′61′E) . El suelo se secó al aire, se pasó por un tamiz de 2 mm y luego se agregó a una maceta (15 pulgadas de diámetro y 11 pulgadas de profundidad) para llenar aproximadamente 21 kg. El suelo se clasificó como franco arenoso con pH 6,57 y conductividad eléctrica de 0,63 dS m−1. Las propiedades químicas del suelo fueron 0,20 % de carbono orgánico, 0,35 % de materia orgánica, 0,02 % de nitrógeno total, 12,00 mg kg−1 de fósforo disponible, 24,50 mg kg−1 de potasio disponible y 3,70 c mol kg−1 de capacidad de intercambio catiónico.

Se realizó un experimento en macetas en un diseño de bloques completos al azar (RCBD) con cuatro repeticiones. El experimento en maceta se realizó durante la temporada de lluvias tempranas (abril a septiembre de 2019). El experimento constó de los siguientes siete tratamientos: testigo sin inoculación bacteriana (W), inoculado con aislado productor de hidrolasa (S4), inoculado con aislado PGP (S8), inoculado con aislado PGP (C2), inoculado con aislado PGP y aislado productor de hidrolasa. aislado (S4S8), inoculado con aislado PGP y aislado productor de hidrolasa (S4C2), inoculado con dos aislados PGP y aislado productor de hidrolasa (S4S8C2). La variedad de alcachofa de Jerusalén HEL65 se preparó como se describe anteriormente. Todos los métodos se realizaron de acuerdo con las directrices y normativas pertinentes. En cada maceta se trasplantó una planta con dos hojas verdaderas y se estableció a la misma profundidad. Cada aislado se cultivó individualmente en medio TSB. Los aislados se cultivaron con agitación de 150 rpm a temperatura ambiente durante 18 h. Las células bacterianas se recogieron por centrifugación a 6000 rpm durante 10 min, luego se lavaron dos veces con agua destilada estéril. Los sedimentos celulares se resuspendieron en NaCl al 0,85 % (p/v) y se ajustaron a una concentración de 109 CFU mL−1. Para la coinoculación y la inoculación en consorcio, se mezclaron volúmenes equivalentes de cada aislado como inóculo. Se inocularon inóculos bacterianos (20 mL) usando una jeringa en la vecindad de las raíces de la plántula.

Se registró la altura de las plantas, los pesos secos de los brotes y las raíces a los 30, 60, 90 días después del trasplante (DDT) y al momento de la cosecha (140 días). Las muestras de brotes y raíces se separaron. Las raíces se colocaron en un tamiz y se enjuagaron cuidadosamente con agua del grifo para eliminar las partículas de tierra. Usando un escáner (Perfection V800™ Photo, Epson), se escaneó y analizó la morfología de la raíz, como la longitud total, el área de superficie, el volumen y el diámetro promedio, usando el software Win-Rhizo Pro2004a (REGENT Instruments Inc., Canadá). Los brotes y raíces se secaron en estufa de aire caliente a 70 °C durante 72 h para masa constante. La biomasa de la planta se presentó utilizando la suma de la masa seca de brotes y raíces. Los parámetros fotosintéticos se midieron a partir de sus hojas verdaderas utilizando un sistema de fotosíntesis portátil (LI-6400XT, LI-COR Bioscience, EE. UU.). El peso fresco de los tubérculos de cada tratamiento se registró al momento de la cosecha.

Los datos in vitro y el experimento en maceta se sometieron a un análisis de varianza de una vía (ANOVA). Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software Statistix 10. La media de los tratamientos de todas las pruebas se identificó mediante la prueba de diferencia mínima significativa (LSD) en p < 0,05.

Las secuencias de ADN de S42 y S81 se han depositado en la DDBJ con los números de acceso LC741254 y LC741255, respectivamente. Gen de Bacillus subtilis S42 para 16S rRNA, secuencia parcial (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucore/LC741254). Gen de Enterobacter cloacae S81 para 16S rRNA, secuencia parcial (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucore/LC741255). Todos los datos de este estudio están disponibles previa solicitud al autor correspondiente en [email protected].

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Este trabajo fue financiado por la beca del fondo de investigación para apoyar a profesores para admitir a un estudiante con alto potencial para estudiar e investigar en su programa de experto en 2017, escuela de posgrado, Universidad de Khon Kaen, Tailandia, ID: 602JT212. Gracias al Sr. Matthew Graham Savage por corregir este manuscrito.

Departamento de Microbiología, Facultad de Ciencias, Universidad de Khon Kaen, Khon Kaen, 40002, Tailandia

Natthawat Sritongon, Sophon Boonlue, Wiyada Mongkolthanaruk y Nuntavun Riddech

Departamento de Agronomía, Facultad de Agricultura, Universidad de Khon Kaen, Khon Kaen, 40002, Tailandia

Sanu Jogloy

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NS desarrolló y analizó el experimento. SB y WM discutieron los resultados. SJ proporcionó materiales vegetales y sugerencias. NR desarrolló el experimento, discutió los resultados y comentó un borrador del manuscrito.

Correspondencia a Nuntavun Riddech.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Sritongon, N., Boonlue, S., Mongkolthanaruk, W. et al. La combinación de múltiples promotores del crecimiento vegetal y rizobacterias productoras de enzimas hidrolíticas y su efecto en la mejora del crecimiento de la alcachofa de Jerusalén. Informe científico 13, 5917 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-33099-x

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Recibido: 01 Diciembre 2022

Aceptado: 07 abril 2023

Publicado: 11 abril 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-33099-x

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